В Vivo изображений и количественного пребывания ангиогенных ответ в опухоли зебрафиш ксенотрансплантатов
Summary
Цель этого метода состоит в том, чтобы создать модель in vivo опухолевого ангиогенеза путем ксенотрансплантации опухолевых клеток млекопитающих в эмбрион зебры, который имеет флуоресцентно обозначенные кровеносные сосуды. С помощью изображения ксенотранспланта и связанных с ним сосудов можно получить количественное измерение ангиогенной реакции.
Abstract
Опухолевой ангиогенез является ключевой целью противораковой терапии, и этот метод был разработан, чтобы обеспечить новую модель для изучения этого процесса in vivo. Ксенотрансплантат зебры создается путем имплантации опухолевых клеток млекопитающих в перивительное пространство двухдневных эмбрионов зебры, а затем измерения степени ангиогенной реакции, наблюдаемой в экспериментальной точке конца до двух дней после имплантации. Ключевым преимуществом этого метода является способность точно квантитаризировать ангиогенную реакцию зебры-хозяина на трансплантат. Это позволяет детально изучить молекулярные механизмы, а также вклад хозяина против опухоли в ангиогенный ответ. Ксенотрансвированные эмбрионы могут подвергаться различным методам лечения, таким как инкубация с потенциальными антиангиогенезными препаратами, для того, чтобы исследовать стратегии по ингибированию опухолевого ангиогенеза. Ангиогенный ответ также может быть живым изображением для того, чтобы изучить более динамичные клеточные процессы. Относительно нетребовательная экспериментальная техника, дешевые затраты на техническое обслуживание зебры и короткие экспериментальные сроки делают эту модель особенно полезной для разработки стратегий по манипулированию опухолевым ангиогенезом.
Introduction
Ангиогенез является одним из классических признаков рака и представляет собой цель противораковой терапии1,2. Для изучения этого процесса, ксенотрансплантат модели рака были созданы путем имплантации опухолевых клеток млекопитающих в животных, таких как мыши3. Модель ксенотранспланта зебры также была разработана, которая включает в себя имплантацию опухолевых клеток в 2 дня после оплодотворения (dpi) зебры, что приводит к быстрому росту кровеносных сосудов зебры в ксенотрансвграф4.
Этот протокол описывает in vivo зебрафиш эмбриона опухоли ксенотрансплантат модели, в которой ангиогенный ответ может быть точно количественно по всему ксенотрансвграф. Этот метод позволяет исследователю изучить, in vivo, молекулярные механизмы, которые лежат в основе опухоли ангиогенной реакции. Генетическая tractability зебры позволяет хозяину вклад быть допрошен, в то время как выбор различных опухолевых клеток линий позволяет вклад опухоли ангиогенез также будет рассмотрен5,6,7. Кроме того, как личинки зебры проницаемы для малых молекул, конкретные ингибиторы пути могут быть использованы или библиотеки наркотиков могут быть проверены для выявления новых ингибиторов опухолевого ангиогенеза8,9,10, 11.
Модель ксенотранспланта эмбриона зебры представляет уникальные преимущества по сравнению с другими моделями ксенотранспланта млекопитающих. Зебрафиш ксенотранспланты дешевле и проще в исполнении, большое количество животных могут быть рассмотрены и живой клеток изображения позволяет детальное изучение поведения клеток4. В отличие от других моделей in vivo, для наблюдения которых требуется до нескольких недель, ангиогенез у ксенотрансплантатов зебры можно наблюдать в пределах 24 ч после имплантации3,4. Однако, отсутствие адаптивной иммунной системы у эмбриональных зебры, в то время как полезно для поддержания ксенотрансплантата, означает, что адаптивный иммунный ответ и его вклад в ангиогенез опухоли не могут быть рассмотрены. Кроме того, отсутствие опухолевых стромальных клеток, неспособность к ортотопически имплантации опухоли и разница в температуре обслуживания между зебрафиши и клетки млекопитающих являются потенциальными недостатками этого метода. Тем не менее, удобство этой модели для живой визуализации и способность точно количественно ангиогенный ответ делает его однозначно полезным для изучения клеточных процессов, которые регулируют ангиогенез опухоли in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Первым важным шагом в протоколе является имплантация опухолевых клеток. Очень важно, чтобы клетки вводились в место, которое позволит ксенотрансплантатуспешно успешно имплантировать в эмбрион, не делая эмбрион отек. Инъекция, которая является слишком передней может позволить клеткам…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим г-на Алхада Махагаонкара за управление учреждением по производству зебры ВОклендского университета и Исследовательским отделом биомедицинских изображений, Школой медицинских наук, Оклендским университетом, за помощь в замедленной конфокальной микроскопии. Эта работа была поддержана Советом по исследованиям в области здравоохранения Новой Зеландии грант (14/105), Королевское общество Новой Зеландии Марсден фонд проекта Грант (UOA1602) и Окленд медицинских исследований Фонд проекта Грант (1116012) присуждается JWA.
Materials
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection |
| Cell culture dish -35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish -100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) – alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 gauge | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25% ) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).
- Ribatti, D. . Tumor Angiogenesis Assays. , (2016).
- Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
- Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
- Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
- Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
- Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Eng, T. C. Y., Astin, J. W. Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).
- Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
- Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
- Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
- Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).
- Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
- Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404 (2016).
- Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).
- Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).
