제브라피시 종양 이종이식에서 숙주 혈관조형성 반응의 생체 내 이미징 및 정량화
Summary
이 방법의 목적은 형광표지된 혈관이 있는 제브라피시 배아로 포유류 종양 세포를 이종이식에 이식함으로써 종양 혈관신생의 생체 내 모델을 생성하는 것이다. 이종이식 및 관련 혈관을 이미징함으로써, 혈관신생 반응의 정량적 측정을 얻을 수 있다.
Abstract
종양 혈관신생은 항암 치료의 주요 표적이며 이 방법은 생체 내에서 이 과정을 연구하는 새로운 모델을 제공하기 위해 개발되었다. 제브라피시 이종이식은 포유류 종양 세포를 2일 후 수정 후 제지피시 배아의 연막 공간에 이식한 다음, 최대 2일까지 실험 종점에서 관찰된 혈관신생 반응의 정도를 측정하여 생성됩니다. 이식 후. 이 방법의 주요 장점은 접목에 대한 제브라피쉬 숙주 혈관신생 반응을 정확하게 정량화하는 능력이다. 이것은 혈관 신생 반응에 호스트 대 종양 기여뿐만 아니라 분자 메커니즘의 상세한 검사를 가능하게합니다. 이종이식 된 배아는 종양 혈관 신생을 억제하는 전략을 조사하기 위해 잠재적 인 항 혈관 신생 약물을 사용하여 배양하는 것과 같은 다양한 치료를 받을 수 있습니다. 혈관 신생 반응은 또한 더 역동적 인 세포 과정을 검사하기 위해 라이브 이미지 화 될 수있다. 상대적으로 까다로운 실험 기술, 제브라피시의 저렴한 유지 보수 비용 및 짧은 실험 타임 라인은 종양 혈관 신생을 조작하는 전략의 개발에 특히 유용합니다.
Introduction
혈관신생은 암의 고전적인 특징 중 하나이며 항암 치료1,2의표적을 나타낸다. 이 과정을 연구하기 위해, 암의 이종이식 모델은 마우스3과같은 동물에 포유류 종양 세포를 이식함으로써 생성되었다. 제브라피시 이종이식 모델도 개발되어 종양 세포를 2일 후 수정(dpi) 제브라피쉬로 이식하여 제브라피시 혈관이 이종이식으로급속히 성장하게 된다4.
이 프로토콜은 혈관신생 반응이 전체 이종이식에 걸쳐 정확하게 정량화될 수 있는 생체 내 제브라피쉬 배아 종양 이종이식 모델을 기술한다. 이 방법은 조사자가 종양 혈관신생 반응을 뒷받침하는 분자 메커니즘을 생체 내에서 검사할 수 있게 한다. 제브라피시의 유전성성은 숙주 기여도를 심문할 수 있게 하고, 다른 종양 세포주를 선택하면 혈관신생에대한 종양 기여도도 5,6,7을검사할 수 있다. 또한, 제브라피쉬 유충이 소분자에 투과성됨에 따라, 특정 경로 억제제가 사용될 수 있거나 약물 라이브러리를 스크리브하여종양 혈관신생의 신규 억제제를 식별할 수 있다 8,9,10, 11.
제브라피쉬 배아 이종이식 모델은 다른 포유류 이종이식 모델과 비교하여 고유한 이점을 제공합니다. Zebrafish 이종이식은 저렴하고 수행하기 쉬우며, 많은 수의 동물을 검사할 수 있으며 살아있는 세포 이미징을 통해 세포 행동을 자세히 검사 할 수있습니다4. 유의한 혈관 성장을 관찰하기 위해 최대 몇 주가 필요한 생체 내 모델과 달리, 제브라피시 이종이식에서혈관신생은 이식 후 24시간 이내에 관찰될 수 있다3,4. 그러나, 배아 제브라피시에 적응성 면역 계통의 부족은, 이종이식을 유지하는 데 유익하면서, 적응성 면역 반응 및 종양 혈관신생을 향한 그것의 기여가 검토될 수 없다는 것을 의미한다. 또한, 종양 기질 세포의 부족, 종양을 직교적으로 이식할 수 없는 무능력 및 제브라피시와 포유류 세포 사이의 유지 보수 온도의 차이는 이 방법의 잠재적 약점이다. 그럼에도 불구하고, 살아있는 화상 진찰을 위한 이 모형의 어메니티 및 정확하게 혈관신생 반응을 양량하는 기능은 생체내에서 종양 혈관신생을 조절하는 세포 과정을 연구하는 것을 유일하게 유익하게 만듭니다.
Protocol
1. 미세 주사 바늘의 준비 마이크로파이펫 풀러를 켜고 다음 파라미터(재료 표에 나열된 마이크로파이펫 풀러 모델에 대해 보정됨): 열, 680; 당기기, 75; 속도, 40; 시간, 55; 압력: 530. 보로실리케이트 유리 모세관을 마이크로파이펫 풀러에 고정하고 모세관을 당겨 두 개의 바늘을 만듭니다. 원하는 만큼 바늘을 반복하십시오. 2. 이식용 세포 배양 …
Representative Results
6, 24 및 48 hpi에서 개별 이종이식을 이미징함으로써, 상이한 시점에서의 혈관신생 반응은 도 1A-C에 도시된 바와 같이 계산될 수 있다. 가장 큰 혈관 신생 반응은 이식 후 24-48 시간 사이에서 관찰되며, 접목 혈관의 최대 수준은 2 dpi (그림1A-C)에서볼 수 있습니다. B16-F1 이종이식에 대한 전형적인 혈관신생 …
Discussion
프로토콜의 첫 번째 중요한 단계는 종양 세포의 이식입니다. 세포가 배아 부종을 만들지 않고 배아에 성공적으로 이식 할 수있는 위치에 세포를 주입하는 것이 필수적입니다. 너무 앞쪽인 주사는 세포가 심장쪽으로 움직이도록 허용하여 혈류를 차단하고 부종으로 이어질 수 있으며, 너무 후방인 주사는 이식이 제대로 되지 않습니다. 전방 주사는 주입으로 심혼에서 멀리 가리키도록 후방 방향으?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 오클랜드 제브라피시 대학과 오클랜드 대학 의학 과학 대학, 의학 대학, 시간 경과 공초점 현미경 검사법에 도움을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 뉴질랜드 프로젝트 보조금의 건강 연구 위원회 (14/105), 뉴질랜드 마스덴 기금 프로젝트 보조금의 왕립 학회 (UOA1602) 및 오클랜드 의학 연구 재단 프로젝트 보조금 (1116012) J.W.A에 수여에 의해 지원되었다.
Materials
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection |
| Cell culture dish -35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish -100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) – alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 gauge | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25% ) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
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Cite This Article
Britto, D. D., Hall, C. J., Astin, J. W. In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts. J. Vis. Exp. (150), e59849, doi:10.3791/59849 (2019).