In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts
Summary
El objetivo de este método es generar un modelo in vivo de angiogénesis tumoral mediante células tumorales de mamíferos xenografting en un embrión de pez cebra que tiene vasos sanguíneos marcados fluorescentemente. Mediante la toma de imágenes del xenoinjerto y los vasos asociados, se puede obtener una medición cuantitativa de la respuesta angiogénica.
Abstract
La angiogénesis tumoral es un objetivo clave de la terapia contra el cáncer y este método ha sido desarrollado para proporcionar un nuevo modelo para estudiar este proceso in vivo. Un xenoinjerto de pez cebra se crea implantando células tumorales de mamíferos en el espacio perivitelina de dos embriones de pez cebra de post-fertilización de días, seguido de medir la extensión de la respuesta angiogénica observada en un punto final experimental de hasta dos días postimplantación. La ventaja clave de este método es la capacidad de cuantificar con precisión la respuesta angiogénica del huésped de pez cebra al injerto. Esto permite un examen detallado de los mecanismos moleculares, así como de la contribución del huésped contra el tumor a la respuesta angiogénica. Los embriones xenoinjerados pueden ser sometidos a una variedad de tratamientos, como la incubación con posibles fármacos anti-angiogénesis, con el fin de investigar estrategias para inhibir la angiogénesis tumoral. La respuesta angiogénica también puede ser imagen en vivo con el fin de examinar procesos celulares más dinámicos. La técnica experimental relativamente poco exigente, los costos de mantenimiento baratos del pez cebra y la breve línea de tiempo experimental hacen que este modelo sea especialmente útil para el desarrollo de estrategias para manipular la angiogénesis tumoral.
Introduction
La angiogénesis es una de las señas de identidadclásicas del cáncer y representa un objetivo de la terapia contra el cáncer 1,2. Para estudiar este proceso, se han creado modelos de xenoinjerto de cáncermediante la implantación de células tumorales de mamíferos en animales como ratones 3. También se ha desarrollado un modelo de xenoinjerto de pez cebra, que implica la implantación de células tumorales en 2 días después de la fertilización (dpi) peces cebra que resulta en el crecimiento rápido de los vasos sanguíneos del pez cebra en el xenoinjerto4.
Este protocolo describe un modelo de xenoinjerto tumoral de embrión de pez cebra in vivo en el que la respuesta angiogénica se puede cuantificar con precisión en todo el xenoinjerto. Este método permite al investigador examinar, in vivo, los mecanismos moleculares que sustentan la respuesta angiogénica tumoral. La traibilidad genética del pez cebra permite interrogar la contribución del huésped, mientras que la selección de diferentes líneas celulares tumorales permite examinar también la contribución tumoral a la angiogénesis5,6,7. Además, como las larvas de pez cebra son permeables a moléculas pequeñas, se pueden utilizar inhibidores de víaespecíficos específicos o se pueden analizar bibliotecas de medicamentos para identificar nuevos inhibidores de la angiogénesis tumoral8,9,10, 11.
El modelo de xenoinjerto de embrión de pez cebra presenta ventajas únicas en comparación con otros modelos de xenoinjerto de mamíferos. Los xenoinjertos de pez cebra son más baratos y fáciles de realizar,se puede examinar un gran número de animales y las imágenes de células vivas permiten un examen detallado del comportamiento celular 4. A diferencia de otros modelos in vivo, que requieren hasta varias semanas para observar un crecimiento significativo de los vasos, se puede observar angiogénesis en xenoinjertos de peces cebra dentro de las 24 horas después de la implantación3,4. Sin embargo, la falta de un sistema inmunitario adaptativo en el pez cebra embrionario, aunque beneficioso para mantener el xenoinjerto, significa que no se puede examinar la respuesta inmune adaptativa y su contribución a la angiogénesis tumoral. Además, la falta de células estromales tumorales, la incapacidad para implantar ortotótopopicamente el tumor y la diferencia en la temperatura de mantenimiento entre el pez cebra y las células de mamíferos son posibles debilidades de este método. Sin embargo, la amenabilidad de este modelo para la toma de imágenes en vivo y la capacidad de cuantificar con precisión la respuesta angiogénica hace que sea excepcionalmente beneficioso para el estudio de los procesos celulares que regulan la angiogénesis tumoral in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El primer paso crítico en el protocolo es la implantación de células tumorales. Es esencial que las células se inyecten en un lugar que permita que el xenoinjerto se implante con éxito en el embrión sin hacer que el embrión sea edematoso. Una inyección demasiado anterior puede permitir que las células se muevan hacia el corazón, bloqueando el torrente sanguíneo y provocando edema, mientras que una inyección demasiado posterior dará lugar a un xenoinjerto mal implantado. Una inyección anterior se evita mejor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Sr. Alhad Mahagaonkar por administrar las instalaciones de peces cebra de la Universidad de Auckland y la Unidad de Investigación de Imágenes Biomédicas de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Auckland, por su asistencia en la microscopía confocal de lapso de tiempo. Este trabajo fue apoyado por una subvención del proyecto del Consejo de Investigación Sanitaria de Nueva Zelanda (14/105), una Beca de Proyecto del Fondo Marsden de la Royal Society of New Zealand (UOA1602) y una Beca de Proyecto de la Fundación de Investigación Médica de Auckland (1116012) otorgada a J.W.A.
Materials
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection |
| Cell culture dish -35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish -100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) – alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 gauge | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25% ) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
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