ज़ेब्राफ़िश ट्यूमर Xenografts में मेजबान एंजियोजेनिक प्रतिक्रिया के Vivo इमेजिंग और क्वांटिटेशन में
Summary
इस विधि का उद्देश्य एक ज़ेब्राफ़िश भ्रूण है कि फ्लोरोसेंट लेबल रक्त वाहिकाओं में स्तनधारी ट्यूमर कोशिकाओं को xenografting द्वारा ट्यूमर एंजियोजेनेसिस के एक in vivo मॉडल उत्पन्न करने के लिए है। xenograft और संबंधित वाहिकाओं इमेजिंग द्वारा, angiogenic प्रतिक्रिया की एक मात्रात्मक माप प्राप्त किया जा सकता है.
Abstract
ट्यूमर एंजियोजेनेसिस विरोधी कैंसर चिकित्सा का एक प्रमुख लक्ष्य है और इस विधि विवो में इस प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक नया मॉडल प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है। एक ज़ेब्राफ़िश जेनोग्रैफ्ट स्तनधारी ट्यूमर कोशिकाओं को दो दिन के बाद निषेचन जेब्राफ़िश भ्रूण के perivitelline अंतरिक्ष में प्रत्यारोपित करके बनाया जाता है, इसके बाद दो दिनों तक एक प्रयोगात्मक समापन बिंदु पर मनाया एंजियोजेनिक प्रतिक्रिया की सीमा को मापने के बाद प्रत्यारोपण के बाद. इस विधि के लिए महत्वपूर्ण लाभ के लिए सही भ्रष्टाचार के लिए ज़ेब्राफ़िश मेजबान angiogenic प्रतिक्रिया मात्रा निर्धारित करने की क्षमता है. यह आणविक तंत्र के साथ ही एंजियोजेनिक प्रतिक्रिया के लिए मेजबान बनाम ट्यूमर योगदान की विस्तृत परीक्षा में सक्षम बनाता है। xenografted भ्रूण ट्यूमर angiogenesis को बाधित करने के लिए रणनीतियों की जांच करने के लिए, संभावित विरोधी एंजियोजेनेसिस दवाओं के साथ ऊष्मायन के रूप में उपचार की एक किस्म के अधीन किया जा सकता है। अधिक गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एंजियोजेनिक प्रतिक्रिया को लाइव-इमेज भी किया जा सकता है। अपेक्षाकृत unmanding प्रयोगात्मक तकनीक, ज़ेब्राफ़िश के सस्ते रखरखाव लागत और कम प्रयोगात्मक समय इस मॉडल ट्यूमर angiogenesis हेरफेर करने के लिए रणनीतियों के विकास के लिए विशेष रूप से उपयोगी बनाते हैं.
Introduction
एंजियोजेनेसिस कैंसर की क्लासिक पहचान में से एक है और विरोधी कैंसर चिकित्सा1,2के लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करता है। इस प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए, कैंसर के exograft मॉडल ऐसे चूहों3के रूप में जानवरों में स्तनधारी ट्यूमर कोशिकाओं प्रत्यारोपण द्वारा बनाया गया है. एक ज़ेब्राफ़िश जेनोग्रैफ्ट मॉडल भी विकसित किया गया है, जिसमें 2 दिनों के बाद निषेचन (डीपीआई) जेब्राफ़िश में ट्यूमर कोशिकाओं का प्रत्यारोपण शामिल है जिसके परिणामस्वरूप जेब्राफ़िश रक्त वाहिकाओं के जेब्राग्राफ4में तेजी से वृद्धि होती है।
इस प्रोटोकॉल में एक विवो जेब्राफ़िश भ्रूण ट्यूमर xenograft मॉडल है जिसमें angiogenic प्रतिक्रिया सही पूरे exograft भर में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है का वर्णन करता है. इस विधि अन्वेषक की जांच करने के लिए अनुमति देता है, विवो में, आणविक तंत्र है कि ट्यूमर angiogenic प्रतिक्रिया underpin. जेब्राफिश की आनुवंशिक पथ्यता मेजबान के योगदान से पूछताछ करने की अनुमति देती है , जबकि विभिन्न ट्यूमर कोशिका लाइनों के चयन से एंजियोजेनेसिस में ट्यूमर के योगदान की भी जांच की जा सकती है5,6,7. इसके अलावा, के रूप में ज़ेब्राफ़िश लार्वा छोटे अणुओं के लिए पारगम्य हैं, विशिष्ट मार्ग inhibitors इस्तेमाल किया जा सकता है या दवा पुस्तकालयों ट्यूमर एंजियोजेनेसिस8,9,10के उपन्यास inhibitors की पहचान करने के लिए जांच की जा सकती है 11|
जेब्राफ़िश भ्रूण xenograft मॉडल अन्य स्तनधारी जेनोग्रैफ्ट मॉडल के साथ तुलना में अद्वितीय लाभ प्रस्तुत करता है। ज़ेब्राफ़िश xenografts सस्ता और प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं, जानवरों की बड़ी संख्या की जांच की जा सकती है और लाइव सेल इमेजिंग सेल व्यवहार4की विस्तृत जांच की अनुमति देता है। विवो मॉडल में अन्य के विपरीत, जो महत्वपूर्ण पोत विकास का निरीक्षण करने के लिए कई हफ्तों तक की आवश्यकता होती है, जेब्राफ़िश एक्सोग्रैफ्ट में एंजियोजेनेसिस प्रत्यारोपण3,4के बाद 24 एच के भीतर देखा जा सकता है। हालांकि, भ्रूण जेब्राफ़िश में एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी है, जबकि xenograft को बनाए रखने के लिए फायदेमंद है, इसका मतलब है कि अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और ट्यूमर एंजियोजेनेसिस की दिशा में इसके योगदान की जांच नहीं की जा सकती है। इसके अलावा, ट्यूमर स्ट्रॉमल कोशिकाओं की कमी, ट्यूमर को ऑर्थोटॉपिक रूप से प्रत्यारोपित करने में असमर्थता और जेब्राफ़िश और स्तनधारी कोशिकाओं के बीच रखरखाव के तापमान में अंतर इस विधि की संभावित कमजोरियां हैं। फिर भी, लाइव इमेजिंग के लिए इस मॉडल की सुविधा और एंजियोजेनिक प्रतिक्रिया को सही ढंग से परिमाणित करने की क्षमता यह विशिष्ट सेलुलर प्रक्रियाओं है कि विवो में ट्यूमर एंजियोजेनेसिस को विनियमित अध्ययन के लिए फायदेमंद बनाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में पहला महत्वपूर्ण कदम ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण है. यह आवश्यक है कि कोशिकाओं को एक स्थान है कि exograft भ्रूण edematous बनाने के बिना भ्रूण में सफलतापूर्वक प्रत्यारोपण करने की अनुमति देगा में इ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ऑकलैंड ज़ेब्राफ़िश सुविधा विश्वविद्यालय और बायोमेडिकल इमेजिंग रिसर्च यूनिट, स्कूल ऑफ मेडिकल साइंसेज, ऑकलैंड विश्वविद्यालय, समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी में सहायता के लिए के प्रबंधन के लिए श्री Alhad Mahagaonkar धन्यवाद. यह काम न्यूजीलैंड परियोजना अनुदान के एक स्वास्थ्य अनुसंधान परिषद (14/105), न्यूजीलैंड Marsden फंड परियोजना अनुदान (UOA1602) और एक ऑकलैंड चिकित्सा अनुसंधान फाउंडेशन परियोजना अनुदान (1116012) के एक रॉयल सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया था J.W.A. को सम्मानित किया.
Materials
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection |
| Cell culture dish -35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish -100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) – alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 gauge | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25% ) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).
- Ribatti, D. . Tumor Angiogenesis Assays. , (2016).
- Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
- Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
- Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
- Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
- Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Eng, T. C. Y., Astin, J. W. Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).
- Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
- Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
- Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
- Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).
- Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
- Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404 (2016).
- Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).
- Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).
