I vivo Imaging og kvantifisering av Host angiogenic Response i sebrafisk tumor Xenotransplantater
Summary
Målet med denne metoden er å generere en in vivo modell av tumor angiogenese ved xenografting pattedyr tumorceller til et sebrafisk embryo som har fluorescensmerkete blodkar. Ved å avbilde xenograft og tilhørende fartøy, kan en kvantitativ måling av angiogenic respons oppnås.
Abstract
Tumor angiogenese er et viktig mål for anti-kreft terapi og denne metoden er utviklet for å gi en ny modell for å studere denne prosessen in vivo. En sebrafisk xenograft er skapt av implanting pattedyr tumorceller inn i perivitelline plass av to dager-post-befruktning sebrafisk embryo, etterfulgt av å måle omfanget av angiogenic respons observert på et eksperimentelt endepunkt opp til to dager etter implantation. Det nøkkel fordel å denne metoden er evnen å akkurat quantitate det sebrafisk vert angiogenic svaret å det pode. Dette muliggjør detaljert undersøkelse av molekylære mekanismer samt verten vs tumor bidrag til angiogenic respons. Den xenografted embryo kan bli utsatt for en rekke behandlinger, for eksempel inkubasjons med potensielle anti-angiogenese narkotika, for å undersøke strategier for å hemme tumor angiogenese. Den angiogenic responsen kan også være levende avbildet for å undersøke mer dynamiske cellulære prosesser. Den relativt lite krevende eksperimentell teknikk, billige vedlikeholdskostnader av sebrafisk og korte eksperimentelle tidslinjen gjør denne modellen spesielt nyttig for utvikling av strategier for å manipulere tumor angiogenese.
Introduction
Angiogenese er en av de klassiske kjennetegnene av kreft og representerer et mål for anti-kreft terapi1,2. For å studere denne prosessen, xenograft modeller av kreft har blitt skapt av implanting pattedyr tumorceller til dyr som mus3. En sebrafisk xenograft modellen har også blitt utviklet, som innebærer implantation av tumorceller i 2 dager etter befruktning (dpi) sebrafisk som resulterer i rask vekst av sebrafisk blodkar i xenograft4.
Denne protokollen beskriver en in vivo sebrafisk embryo tumor xenograft modell der angiogenic responsen kan være nøyaktig quantitated over hele xenograft. Denne metoden gjør at etterforsker å undersøke, in vivo, den molekylære mekanismer som underbygger tumor angiogenic respons. Den genetiske føyelighet til sebrafisk gjør at verts bidraget kan bli avhørt, mens valg av ulike tumor cellelinjer gjør at tumor bidraget til angiogenese også kan undersøkes5,6,7. I tillegg, som sebrafisk larver er gjennomtrengelig for små molekyler, kan spesifikk sti hemmere brukes eller medikament biblioteker kan bli vist for å identifisere romanen hemmere av tumor angiogenese8,9,10, 11i.
Den sebrafisk embryo xenograft modellen presenterer unike fordeler sammenlignet med andre pattedyr xenograft modeller. Sebrafisk xenotransplantater er billigere og enklere å utføre, kan et stort antall dyr undersøkes og live celle bildebehandling gir detaljert undersøkelse av celle atferd4. I motsetning til andre in vivo-modeller, som krever opp til flere uker for å observere betydelig fartøy vekst, kan angiogenese i sebrafisk xenotransplantater observeres innen 24 h etter implantat3,4. Men mangelen på en adaptiv immunsystem i embryonale sebrafisk, mens fordelaktig å opprettholde xenograft, betyr at adaptive immunresponsen og dens bidrag til tumor angiogenese kan ikke undersøkes. I tillegg er mangelen på tumor stromal celler, manglende evne til å orthotopically implantatet svulsten og forskjellen i vedlikeholds temperatur mellom sebrafisk og pattedyrceller er potensielle svakheter ved denne metoden. Likevel, amenability av denne modellen for Live Imaging og evnen til å nøyaktig quantitate den angiogenic responsen gjør det unikt fordelaktig for å studere cellulære prosesser som regulerer tumor angiogenese in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det første kritiske trinnet i protokollen er implantation av tumorceller. Det er viktig at cellene injiseres i et sted som vil tillate xenograft å implantatet vellykket i fosteret uten å gjøre embryo edematous. En injeksjon som er for fremre kan tillate cellene til å bevege seg mot hjertet, blokkerer blodet og fører til ødem, mens en injeksjon som er for bakre vil resultere i en dårlig implantert xenograft. En fremre injeksjon er best unngås ved å sette inn nålen gjennom eggeplomme sac i en fremre til bakre re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Mr. Alhad Mahagaonkar for å håndtere University of Auckland sebrafisk anlegget og Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland, for assistanse i time-lapse konfokalmikroskopi mikroskopi. Dette arbeidet ble støttet av et prosjekt stipend for helse forskningsråd på New Zealand (14/105), en Royal Society of New Zealand Marsden Fund Project Grant (UOA1602) og en Auckland Medical Research Foundation Project Grant (1116012) tildelt J.W.A.
Materials
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection |
| Cell culture dish -35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish -100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) – alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 gauge | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25% ) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).
- Ribatti, D. . Tumor Angiogenesis Assays. , (2016).
- Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
- Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
- Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
- Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
- Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Eng, T. C. Y., Astin, J. W. Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).
- Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
- Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
- Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
- Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).
- Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
- Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404 (2016).
- Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).
- Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).
