التحسين والتصميم وتجنب المزالق في الكيمياء المناعية الفلورية متعددة اليدوية
Summary
تعدد الكيمياء المناعية الفلورية هي التكنولوجيا الناشئة التي تمكن التصور من أنواع الخلايا متعددة داخل سليمة شكلي الثابتة، البارافين جزءا لا يتجزأ من (FFPE) الأنسجة. تقدم هي المبادئ التوجيهية لضمان متعددة 7 ألوان ناجحة مع تعليمات لتحسين الأجسام المضادة والكواشف، وإعداد الشرائح، والتصميم ونصائح لتجنب المشاكل الشائعة.
Abstract
تقييم البيئة الدقيقة للأنسجة السليمة لتحليل تسلل الخلايا والتنظيم المكاني أمر ضروري لفهم تعقيد عمليات المرض. وتشمل التقنيات الرئيسية المستخدمة في الماضي الكيمياء المناعية (IHC) والفلورة المناعية (IF) التي تمكن تصور الخلايا كلقطة في الوقت المناسب باستخدام ما بين 1 و 4 علامات. ولكل من التقنيات أوجه قصور، بما في ذلك صعوبة تلطيخ الأهداف غير المضادة للجينات والقيود المتصلة بالتفاعل بين الأنواع. IHC موثوق بها واستنساخها، ولكن طبيعة الكيمياء والاعتماد على الطيف الضوئي المرئي يسمح فقط لعدد قليل من العلامات لاستخدامها ويجعل التعريب المشترك تحديا. استخدام IF يوسع علامات المحتملة ولكن عادة ما يعتمد على الأنسجة المجمدة بسبب الفلورة الأنسجة واسعة النطاق بعد تثبيت رسمي. قياس التدفق الخلوي، وهي تقنية تمكن من وضع علامات متزامنة على الepitopes متعددة، يلغي العديد من أوجه القصور في IF وIHC، ومع ذلك، فإن الحاجة إلى فحص الخلايا كما تعليق خلية واحدة يفقد السياق المكاني للخلايا التخلص من البيولوجية الهامة العلاقات. تعدد الكيمياء المناعية الفلورية (mfIHC) الجسور هذه التكنولوجيات مما يسمح لمتعدد epitope الفينولات الخلوية في البارافين ثابت ة رسمية جزءا لا يتجزأ (FFPE) الأنسجة مع الحفاظ على الهندسة المعمارية البيئية الدقيقة الشاملة والمكانية علاقة الخلايا داخل الأنسجة غير المعطلة سليمة. عالية الكثافة الفلورسنت الفلوروفور التي ترتبط بشكل مشترك إلى epitope الأنسجة تمكن تطبيقات متعددة من الأجسام المضادة الأولية دون القلق من الأنواع محددة عبر التفاعل من قبل الأجسام المضادة الثانوية. على الرغم من أن هذه التكنولوجيا قد ثبت لإنتاج صور موثوقة ودقيقة لدراسة المرض، فإن عملية إنشاء استراتيجية تلطيخ mfIHC مفيدة يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وصارمة بسبب التحسين والتصميم واسعة النطاق. من أجل جعل الصور القوية التي تمثل التفاعلات الخلوية دقيقة في الموقع والتخفيف من فترة التحسين للتحليل اليدوي، المعروضة هنا هي طرق لإعداد الشريحة، وتحسين الأجسام المضادة، وتصميم متعددة، فضلا عن الأخطاء التي تواجهها عادة خلال عملية تلطيخ.
Introduction
التصور من البيئة الدقيقة الورم سليمة (TME) أمر ضروري في تقييم ليس فقط التسلل الخلوي في الأورام الخبيثة الصلبة ولكن الخلية إلى تفاعلات الخلية كذلك. وقد ظهرت متعددة الفلورسنت الكيمياء المناعية (mfIHC) كأداة فعالة لمتعددة مستضد الفينولمنت من الخلايا في دراسة السرطان والأمراض المرتبطةبها 1،2،3،4، 5و6و7. هذا، جنبا إلى جنب مع البرامج الجديدة والبرامج المصممة لتحليل مجموعاتالبيانات الكبيرة، تمكن من مراقبة التفاعلات المعقدة بين الخلايا 1،2،4. عامل الحد من معدل في الحصول على البيانات هو في كثير من الأحيان نوعية الأنسجة الملونة قبل التحليل.
وتشمل التقنيات السابقة المستخدمة في الخلايا الظاهرية في TME الكيمياء المناعية (IHC)، والفلورة المناعية (IF) وقياس التدفق الخلوي التي تشكل جميعها قيودا ً كبيرة. يستخدم IHC رسميًا أجزاء البارافين المدمجة (FFPE) التي يتم إزالة البارافين وترطيبها قبل أن تلطخت بجسم مضاد واحد في أغلب الأحيان. استخدام بيروكسيداز الفجل (HRP) ملزمة الأجسام المضادة الثانوية ورد الفعل الكيميائي يسمح التصور من epitope مضاد للجينات واحد8. في حين أن IHC موثوق بها وتنفيذها على أنسجة FFPE التي من السهل العمل مع، والقيود على الطيف الضوئي المرئي يعني واحد فقط أو اثنين من علامات يمكن أن تكون موثوقة متميزة والتوطين المشترك من المستضدات من الصعب جدا8. وهناك طريقة لتوسيع العلامات المتاحة وبالتالي المستضدات التي يمكن فحصها على مقطع واحد هو تغيير إلى الفلورة التي تسمح باستخدام مجموعة أوسع من الطيف البصري. بالنسبة للأنسجة المجمدة أو FFPE، يتم نقلها إلى الشرائح والأجسام المضادة المستخدمة التي يتم مترافقة مع مختلف الفلوروفور. في حين أن هذا يزيد من عدد المستضدات التي يمكن التحقيق فيها، هناك العديد من القيود الهامة. أولا، لأن كل الأجسام المضادة عادة ما يكون واحد فقط فلوروفور تعلق، وسطوع في كثير من الأحيان ليست قوية بما فيه الكفاية للتغلب على الفلورة الأنسجة. ولهذا السبب، يتم تنفيذ معظم IF على الأنسجة المجمدة التي هي مكلفة لتخزين ويصعب العمل مع. يتوفر عدد محدود من العلامات الفلورية للاستخدام بسبب التداخل الطيفي وتفاعل الأنواع المتقاطعة خاصة عند استخدام الأجسام المضادة غير المتقارنة. تدفق قياس الخلايا، والذي يتكون من معالجة الأنسجة الطازجة في تعليق خلية واحدة ووضع العلامات مع الأجسام المضادة الفلورسنت كان المعيار الذهبي للمناعة للنماذج المناعية لعقود9،10. فائدة قياس التدفق هو القدرة على تسمية الأجسام المضادة متعددة دون القلق على التفاعل عبر الأنواع كما يتم الجمع بين معظم. لأن الخلايا هي “تصور” من قبل آلة وليس عيون الإنسان، وهناك أكثر بكثير الفلوروفور المتاحة ولكن هذا يأتي مع تكلفة. ويجب أن يتم التعويض يدويا، الأمر الذي يمكن أن يغير إلى حد كبير النتائج التي تسفر عن مجموعات سكانية إيجابية وسلبية زائفة. أهم قيد على قياس التدفق هو أن بنية الأنسجة وبالتالي تفقد جميع المعلومات المكانية بسبب ضرورة تعليق الخلايا المفردة.
تعدد الكيمياء المناعية الفلورية (mfIHC) باستخدام المجهر الفلورسنت الآلي في تركيبة مع برامج جديدة يجمع بين فوائد IHC، IF وقياس التدفق الخلوي من خلال السماح للأنسجة متعددة مستضد تلطيخ مع تضخيم إشارة و الاحتفاظ بالعلاقات المكانية دون الحاجة إلى التعويض. يتم وضع أنسجة FFPE على الشرائح المشحونة التي، بعد استرجاع مستضد، تخضع لجولة من تطبيق الأجسام المضادة الأولية إلى مستضد الهدف من الفائدة تليها الأجسام المضادة الثانوية مع علامة كيميائية HRP، على غرار IHC. بعد وضع الأجسام المضادة الثانوية، وHRP رد فعل محدد يؤدي إلى الفلوروفور ملزمة بشكل مشترك إلى epitope من الفائدة11. مرة واحدة يتم تسمية الأنسجة، يتم الانتهاء من جولة أخرى من التدفئة الشرائح إزالة مجمع الأجسام المضادة الأولية والثانوية المطبقة سابقا ترك فقط علامة الفلورسنت ملزمة إلى epitope الأنسجة11. وهذا يسمح لإعادة تطبيق الأجسام المضادة المتعددة من أي نوع دون القلق من التفاعل المتبادل11،12. ولتقليل أي حاجة إلى تعويض يدوي لأصباغ فلورية متعددة، تُستخدم مجموعة من الفلوروفورات ذات التداخل الطيفي القليل بما في ذلك وصمة عار مضادة نووية لإكمال الـ MFIHC. لحساب الفلورة الذاتية التي تواجهها مع أنسجة FFPE، يطرح البرنامج الفلورة الذاتية من الصورة النهائية باستخدام صورة من شريحة فارغة وهو أمر ممكن بسبب قوة الفلورة مستضد محددة بعد فلوروفور تضخيم الإشارة. باستخدام برامج جديدة مصممة لمجموعات البيانات الكبيرة، يمكن تحديد مواقع الخلايا وتحليلها للسياق المكاني1و2و4. الحد الأكثر أهمية من هذه التقنية هو وقت التحسين. وجدت هنا منهجية مفصلة مع تعليمات للتصميم التجريبي واستراتيجية التلطيخ والتصوير. سوف تكون MFIHC مفيدة للمختبرات التي ليس لديها حاليا نظام تلطيخ الآلي الأمثل التي ترغب في فهم أفضل للسياق المكاني للتفاعلات من خلية إلى خلية في أنسجة FFPE سليمة باستخدام تقنية يدوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا تزال عينات الأنسجة السليمة من خزعة الورم الصلبة واستئصال الجراحة أدوات تشخيصية وتنبؤية هامة لتحليل المرض وكذلك تشخيص المريض. تعدد الكيمياء المناعية الفلورية (mfIHC) هو تقنية جديدة تجمع بين فوائد الكيمياء المناعية (IHC)، الفلورة المناعية (IF) وقياس التدفق الخلوي. وقد سمحت الأساليب السابقة لل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا إد ستاك، الذي كان سابقاً من بيركين إلمر، على مساعدته في إعداد وتحسين تلطيخ المضاعفات الأصلية. كما يود المؤلفون أن يشكروا كريستين شميت من أكويا للعلوم الحيوية على نصائحها باستخدام برنامج التحليل. البحوث التي وردت في هذا المنشور بدعم من المعاهد الوطنية للسرطان والصحة تحت جائزة رقم P30CA046592، K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. وقدم صندوقي جيفري أ. كولبي لسرطان القولون وتوم ليو التذكاري دعما إضافيا.
Materials
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
- Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
- Katikireddy, K. R., O’Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Phenoptics Research Solutions. . Perkin Elmer Manual. , 32 (2016).
- . . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2014).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
