Summary
Multiplex floresan immünhistokimya, bozulmamış formalin-sabit, parafin katıştırılmış (FFPE) dokusu içinde birden fazla hücre türlerinin görselleştirilmesini sağlayan gelişmekte olan bir teknolojidir. Sunulan başarılı bir 7-renk Multiplex antikor ve reaktifler optimize etmek için talimatlar, slaytlar, tasarım ve ortak sorunları önlemek için ipuçları hazırlanması sağlamak için yönergeler vardır.
Abstract
Hücre infiltrasyonu ve mekansal organizasyon analizi için bozulmamış doku mikroçevre değerlendirilmesi hastalık süreçlerinin karmaşıklığını anlamakta esastır. Geçmişte kullanılan prensip teknikleri, 1 ile 4 işaretçileri arasında zaman içinde bir anlık görüntü olarak hücrelerin görselleştirilmesini sağlayan immünhistokimya (ıHC) ve immünofluoresesans (IF) içerir. Her iki teknik de kötü antijenik hedefler ve çapraz türler reaktivite ile ilgili sınırlamalar boyama zorluk dahil eksiklikleri var. IHC güvenilir ve reproducible, ancak kimyasal ve görünür ışık spektrumuna güven doğası sadece birkaç işaretçileri kullanılmak üzere sağlar ve Co-yerelleştirme zorlu yapar. If kullanımı potansiyel işaretçileri genişletir, ancak genellikle formalin fikreasyon aşağıdaki geniş doku otofloresans nedeniyle dondurulmuş doku dayanır. Akış cytometri, birden fazla epiton eşzamanlı etiketleme sağlayan bir teknik, IF ve IFC eksiklikleri birçok CPAP, ancak, tek bir hücre süspansiyon olarak hücreleri incelemek için ihtiyaç önemli biyolojik atarak hücrelerin uzamsal bağlamı kaybeder Ilişki. Multiplex floresan immünhistokimya (mfihc) Bu teknolojiler, genel mikroçevre mimarisi ve mekansal koruyarak formalin sabit parafin gömülü (ffpe) doku Multi-epitope hücresel fenotiplemeyi için izin köprüler bozulmamış doku içinde hücrelerin ilişkisi. Yüksek floresan yoğunluğu fluorophores bu kovalently doku epitopu bağ türü belirli çapraz reaktivite ikincil antikorlar endişe etmeden primer antikorların birden fazla uygulama sağlar. Bu teknoloji hastalığın çalışması için güvenilir ve doğru görüntüler üretmek için kanıtlanmış olmasına rağmen, yararlı bir mfIHC boyama stratejisi oluşturma süreci zaman alıcı ve kapsamlı optimizasyon ve tasarım nedeniyle titiz olabilir. Doğru hücresel etkileşimleri temsil eden ve manuel analiz için optimizasyon süresini azaltmak için sağlam görüntüler yapmak amacıyla, burada sunulan slayt hazırlama, antikorlar, Multiplex tasarım yanı sıra hataları optimize etmek için Yöntemler genellikle boyama işlemi sırasında karşılaşılan.
Introduction
Bozulmamış bir tümör mikroortamının (TME) görselleştirilmesi, sadece katı malignitelerde hücresel infiltrasyonu değil, hücrenin hücre etkileşimlerini de değerlendirmede esastır. Multiplex floresan immünhistokimya (mfihc) kanser ve ilişkili hastalıklar çalışmada hücrelerin Multi-antijen fenotiplemeyi için etkili bir araç olarak ortaya çıkmıştır1,2,3,4, 5,6,7. Bu, büyük veri setleri analiz etmek için tasarlanmış yeni yazılım ve programlar ile birlikte, hücreler1,2,4arasındaki karmaşık etkileşimlerin gözlem sağlar. Veri toplama faktörü sınırlama oranı genellikle analiz öncesinde lekeli doku kalitesidir.
TME 'deki fenotip hücrelerinde kullanılan önceki teknikler arasında immunohistokimya (IHC), immünofluoresesans (IF) ve akış sitometri bulunmaktadır ve bu da önemli sınırlamalar sunar. IHC, en sık bir antikor tarafından lekelenmeden önce deparafsonize edilmiş ve rehydrated olan formalin sabit parafin gömülü (FFPE) doku bölümlerini kullanır. Bir horserpu peroksidaz (HRP) bağlı ikincil antikor ve kimyasal reaksiyon kullanımı tek bir antijenik epitopu görselleştirme sağlar8. IHC güvenilir ve birlikte çalışması kolay FFPE doku üzerinde gerçekleştirilen, görünür ışık spektrumuna sınırlamalar sadece bir veya iki işaretçileri güvenilir seçkin ve antijenlerin kolokalizasyonu oldukça zor8anlamına gelir. Kullanılabilir işaretçileri genişletmek için bir yol ve bu nedenle tek bir bölümde probed edilebilir antijenler görsel spektrumunun daha geniş bir yelpazede kullanımı için izin floresans değiştirmek için. Eğer, dondurulmuş veya FFPE doku slaytlar üzerine transfer edilir ve çeşitli fluorophores konjuyum kullanılan antikorlar. Bu probed edilebilir antijenler sayısını artırır iken, birkaç önemli sınırlamalar vardır. İlk olarak, her antikor genellikle sadece bir fluorophore bağlı olduğundan, parlaklık genellikle doku autofluorescence aşmak için yeterince güçlü değildir. Bu nedenle, çoğu If saklamak için pahalı ve çalışmak zor dondurulmuş doku üzerinde gerçekleştirilir. Floresan etiketleri sınırlı sayıda spektral örtüşme ve çapraz türler reaktivite özellikle olmayan konjued antikorlar kullanıldığında nedeniyle kullanım için kullanılabilir. Tek hücreli süspansiyon içine taze doku işleme ve floresan antikorlar ile etiketleme oluşan akış sitometri, onlarca yıldır immünofenotipleme için altın standart olmuştur9,10. Akış cytometri bir yararı türleri çapraz reaktivite için endişe olmadan çoklu antikorlar etiket yeteneği en konjut olduğu gibi. Hücreler bir makine ve insan gözleri değil "görselleştirilen" Çünkü, çok daha fazla fluorophores mevcuttur ama bu bir maliyet ile birlikte gelir. Tazminat, yanlış pozitif ve negatif nüfus üreten sonuçları önemli ölçüde değiştirebilir el ile yapılmalıdır. Akış sitometri en önemli sınırlama, doku mimarisi ve daha sonra tüm uzamsal bilgiler tek hücreler süspansiyon gereksinimi ile kaybolur.
Yeni yazılım ile birlikte otomatik bir floresan mikroskop kullanan Multiplex floresan immünhistokimya (mfIHC), ıFC, IF ve akış sitometri avantajlarını, sinyal amplifikasyonu ile çok antijen doku boyama ve tazminat gerek kalmadan uzamsal ilişkilerin saklanması. FFPE doku şarj slaytlar üzerine yerleştirilir, antijen alımı sonra, ıFC benzer bir HRP kimyasal etiketi ile ikincil bir antikor takip faiz hedef antijen birincil antikor uygulama bir yuvarlak geçmesi. İkincil antikor yerleştirdikten sonra, bir HRP spesifik reaksiyon bir fluorophore rastlamak ilgi epitopu için bağlayıcı bir sonuç11. Doku etiketlendikten sonra, slaytlar Isıtma başka bir turda sadece floresan etiketi doku epitopu bağlı bırakarak önceden uygulanan birincil ve ikincil antikor kompleksi kaldırma tamamlandı11. Bu, herhangi bir türün birden fazla antikorlarının Cross-reactivity11,12için endişe olmadan yeniden uygulanması için izin verir. Çoklu floresan boyalar manuel telafisi için herhangi bir ihtiyacı en aza indirmek için, bir nükleer sayaç leke dahil olmak üzere küçük spektral örtüşme ile fluorophores bir koleksiyon mfIHC tamamlamak için kullanılır. Ffpe doku ile karşılaşılan otofloresans dikkate almak için, yazılım, florophore aşağıdaki antijen spesifik floresans gücü nedeniyle mümkün olan boş bir slayttan bir görüntü kullanarak son görüntüden otofloresans çıkarır sinyal amplifikasyon. Büyük veri kümeleri için tasarlanmış yeni programları kullanarak, hücre konumları tespit ve uzamsal bağlam1,2,4için analiz edilebilir. Bu tekniğin en önemli sınırlaması optimizasyon zamanidir. Deneysel tasarım ve boyama ve görüntüleme stratejisi talimatlarını içeren ayrıntılı bir metodoloji burada bulunur. mfIHC Şu anda manuel tekniği kullanarak bozulmamış FFPE doku hücre-hücre etkileşimlerin uzamsal bağlamı daha iyi anlamak istiyorum optimize edilmiş otomatik boyama sistemi yok laboratuvarlar için yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm çalışmalar Michigan Üniversitesi 'nin iç İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. birincil antikorlar ve slayt hazırlama optimizasyonu
- Konvansiyonel ıHC kullanarak Multiplex için antikor ideal konsantrasyonu belirleyin.
- Multiplex için antikorları manuel konvansiyonel immünhistokimya (ıHC)13ile test edin.
- Her antikor için bol hücre tipine sahip belirli dokulara, CD3 antikor testi için Bademcik dokusu kullanma gibi test edilir.
- Şirket tarafından önerilen ıHC için referans konsantrasyonu kullanın ve daha sonra önerilen konsantrasyonlarda antikor konsantrasyonları yanı sıra yukarıda ve önerilen konsantrasyon altında konsantrasyonları ile ıHC tamamlayın.
- Formalin sabit parafin gömülü dokusu slaytlar üzerine hazırlayın.
- Microtome kullanarak, 4 ve 6 μm arasında bir kalınlıkta FFPE dokusu blokları kesilmiş ve şarj slaytlar için geçerlidir.
Not: distile su kullanımı, Multiplex boyunca uygun doku montajı ve uyumu sağlar. - Slaytlar düz, doku tarafı yukarı yerleştirin ve 37 °C gece kuru izin.
- Slaytları, Multiplex tamamlamak için hazır olana kadar aşırı sıcaklıktan uzak bir slayt kutusunda saklayın.
- Microtome kullanarak, 4 ve 6 μm arasında bir kalınlıkta FFPE dokusu blokları kesilmiş ve şarj slaytlar için geçerlidir.
2. genel boyama yöntemi
- Yıkama ve antijen alma çözümlerinin hazırlanması
- 0,1% tbst yıkama çözeltisi 9 l deiyonize su, 1 l Tris tamponlu tuz (TBS) ve 10 ml polisorbat 20 ' ye karışarak hazırlayın.
- Hem antijen alma çözümlerini hazırlayın (pH 6 ve pH 9; Malzeme tablosu) deiyonize su ile 1x sulandrarak tarafından.
- Deparafizasyon ve rehidrasyon
- Bake slaytlar, düz yalan, doku tarafı kadar 60 ° c için 1 h bir hibridizasyon fırın1. Fırından slaytlar çıkarın ve en az 5 − 10 dakika soğumasını bekleyin, ardından dikey bir sürgülü rafa yerleştirin.
- Aşağıdaki çözümlerde slaytları sırayla Treat: triplicate içinde ksilolü,% 100 etanol tek bir tedavi izledi,% 95 etanol, ve son olarak% 70 etanol 10 dakika her bir slayt boyama seti1kullanarak.
- 30 dakika13için nötr tamponlu formalin ile dolu bir plastik slayt kutusunda daldırma ile sabitleme tarafından izlenen bir plastik slayt kutusunda dalaşma ile 2 dakika deiyonize su ile slaytlar raf yıkayın. 2 dakika boyunca deiyonize suda slaytlar yıkayın sonra antijen alımı devam.
- Antijen alımı
- Slayt rafı, pH 6 veya pH 9 antijen alma tamponu ile iç hattan (yaklaşık 300 mL) doldurulmuş ısıya dayanıklı bir kutuya yerleştirin.
Not: Antigen alma arabelleği pH 6 veya pH 9 epitope başına optimize edilmesi gerekebilir olabilir. Ancak, nükleer epiton ve pH 6 tüm diğer antikorlar için bağlamak antikorlar için pH 9 kullanarak başlayın. - Kapak plastik wrap ile kutuyu ve güvenli bir lastik bant kullanın. Kutuyu, dönen plakanın kenarındaki mikrodalga fırınına yerleştirin (mikrodalga ısıtma için evirici teknolojisiyle donatılmış olmalıdır). 45 s için slaytları% 100 güç ile% 20 güç13' te 15 dakika takip ederek ısıtın.
Not: mikrodalga tedavi kullanılan mikrodalga bağlı optimizasyon gerekebilir. - Slaytlar yaklaşık 15 − 20 dakika boyunca soğumaya bırakın.
- Slayt rafı, pH 6 veya pH 9 antijen alma tamponu ile iç hattan (yaklaşık 300 mL) doldurulmuş ısıya dayanıklı bir kutuya yerleştirin.
- Soğuk slaytlar iken antikorlar ve fluorophores çalışma çözümleri hazırlayın.
- 0,5 g Sığır serum albümin granüller 50 ml tbst içine çözünerek primer antikor seyreltici hazırlayın. Alternatif olarak, granüller çözülür 1x fosfat tamponlu tuz (PBS) 50 mL kullanın.
- Her primer antikor çalışma çözümünü, birincil antikor seyreltildiği Bölüm 1 ' de belirlenen en iyileştirilmiş konsantrasyona yapın. Slayt başına yaklaşık 200 μL tahmin edin.
- 1:100 konsantrasyonunda fluorophore seyreltme her fluorophore seyreltilerek fluorophore çalışma çözümünü hazırlayın.
Not: Bu antikor bağlı olarak optimize edilmesi gerekebilir. Slayt başına yaklaşık 100 μL tahmin edin. - Boyama son gününde, hazırlamak 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) TBST 1 mL içine DAPI 3 damla ekleyerek çalışma çözümü.
- Slayt boyama (yıkama ve engelleme)
- Soğutduktan sonra mikrodalga kutusunu çıkarın ve plastik wrap kapalı almak, 2 dakika boyunca deiyonize su ile slaytlar yıkayın bir plastik slayt kutusunda 2 dakika yıkama tarafından izlenen TBST13.
- Hassas bir görev ile doku etrafında her slayt kurutduktan sonra doku kuru izin değil dikkatli silin, bir hidrofobik bariyer kalem kullanarak doku dışında etrafında iz. Hassas görev silme veya kalem ile dokuya dokunmayın.
- Her slaytı nemlendirilmiş Odaya yerleştirin ve dokuya engelleme çözeltisi (yaklaşık 4 damla) ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca inküye yapın.
- Slayt boyama (primer antikor uygulaması)
- Her slayt alın ve kağıt havlu yığını üzerinde slaytın tarafına dokunarak ve hassas bir görev doku etrafında aşırı engelleme aracı kaldırmak için silin kullanarak engelleme çözümü kaldırın.
- Slaytı geri nemlendirilmiş Odaya yerleştirin ve çalışma primer antikor yaklaşık 200 μL ekleyin. RT 'de 1 saat boyunca nemlendirilmiş odada inküye yapın.
- Triplicate13' te daldırma ile 2 dakika boyunca tbst ile yıkayın.
Not: her yıkama adımında, TBST değiştirme daha temiz bir görüntü sağlamaya yardımcı olacaktır.
- Slayt boyama (ikincil antikor uygulaması)
- Her slayttan kalan TBST kapalı DAB ve ikincil antikor yaklaşık 3 ila 4 damla uygulamak (tavşan ve fare ikincil HRP konjuze antikorlar karışımı). RT13' te nemlendirilmiş odada 10 dakika boyunca inküye yapın.
Not: fare veya tavşan dışında ikincil bir antikor gerektiren veya alternatif bir ikincil antikor kullanmayı tercih eden bir primer antikor kullanmayı planlıyorsanız, slaytlara ikincil konjuli uygun HRP 'yi uygulayın ve 45 dk için RT 'de inkük edin. optimizasyonu Alternatif ikincil14için inkübasyon süresi gerekebilir. - İnkübasyon sonrası, TBST ile 2 dakika boyunca triplicate13ile yıkayın.
- Her slayttan kalan TBST kapalı DAB ve ikincil antikor yaklaşık 3 ila 4 damla uygulamak (tavşan ve fare ikincil HRP konjuze antikorlar karışımı). RT13' te nemlendirilmiş odada 10 dakika boyunca inküye yapın.
- Slayt boyama (fluorophore uygulaması)
- Fluorophore çalışma çözeltisi yaklaşık 100 μL uygulayın ve 10 dk13için RT 'de nemlendirilmiş odada inküye yapın.
- TBST ile 2 dakika boyunca triplicate13ile yıkayın.
- Antikorların kaldırılması
- Mikrodalga kaydırakları (45 s% 100 daha sonra 15 dk% 20) ısıya dayanıklı kutuda (bkz. Adım 2.3.2) antikorların kaldırılması için13,14.
Not: Bu Multiplex bir turda tamamlar. Bu, protokol duraklatılabilen tek noktasıdır. Protokolü duraklatmak için, slaytları antijen alma arabelleğinde gece oda sıcaklığında bırakın.
- Mikrodalga kaydırakları (45 s% 100 daha sonra 15 dk% 20) ısıya dayanıklı kutuda (bkz. Adım 2.3.2) antikorların kaldırılması için13,14.
- Boyama ek tur devam edin. , Antikor-fluorophore çiftleri geri kalanı için 2.5.1 − 2.9.1 adımlarını yineleyin. Tüm antikorlar ve fluorophores kullanıldığında, Bölüm 2,11 devam edin.
- DAPı uygulaması ve montajı
- Multiplex son boyama yuvarlak sonra, antijen alma solüsyonu pH 613ile son antikor uygulama çıkarın. 2 dakika her13için tbst takip deiyonize su ile yıkayın.
- Çalışma DAPı çözeltisi yaklaşık 150 μL 'yi slaytlara uygulayın ve RT1' de nemlendirilmiş odada 10 dakika boyunca inküye yapın.
- Yaklaşık 30 s için TBST ile yıkayın ve bir antifade mountant ile montaj Cover,. Montaj medya lamel magazini güvenli (opsiyonel) kurutulur kez lamel magazini dört köşesinde açık tırnak cilası uygulayın.
3. Kütüphane, monoplexes ve Multiplex detayları
- Fluorophore Kütüphanesi oluşturmak için slaytlar seçin.
- 7 renkli Multiplex için Kütüphane için 7 bağışıklık hücresi zengin doku kaydırağı (örneğin, bademcik, dalak, vb.) toplayın.
Not: Multiplex kullanılan her benzersiz fluorophore temsil eden her slayt ile bir fluorophore Kütüphanesi için kullanılacak kontrol slaytları seçin. Kontrol slaytlar seçim bol epitopu olmalıdır ve her fluorophore için doku aynı türde olabilir.
- 7 renkli Multiplex için Kütüphane için 7 bağışıklık hücresi zengin doku kaydırağı (örneğin, bademcik, dalak, vb.) toplayın.
- Monoplexes ve multiplexes ile kullanım için leke ve görüntü kütüphanesi slaytlar.
- Kontrol slaytlarını kullanarak 2.1 − 2.9.1 adımları izleyin ve seçim doku slaytlar kontrol edin. 1:100 konsantrasyonunda her slayda farklı bir fluorophore yerleştirin; bir slayt yalnızca DAPı içermelidir.
- DAPı boyama atlamak dışında Bölüm 2,11 devam edin ve bunun yerine TBST kullanın ve açıklandığı gibi bağlayın.
- Tüm kanallar DAPı, CY3, CY5, CY7, Texas Red, Yarıiletken kuantum noktalar ve floresan ısothiocyanate (FITC) ile% 250 MS doygunluk koruma özelliği ayarı ile görüntü, bir gecede kuru slaytlar izin sonra1.
Not: pozlama süreleri 50 − 250 MS13' de ayarlanabilir. - Kitaplık görüntülerini yazılım üzerine yükleyin ve monopleler ve Multiplex analizinde kullanın.
- Monoplexes için slaytlar seçin.
- Optimize antikorlar (Bölüm 1) dayalı seçim bol epitopu olan kontrol slaytlar seçin. Her yuvarlak boyama için Multiplex yapılacak, bu sayıda kontrol slaytları monoplexes oluşturmak için seçin.
Not: monoplex amacı, Multiplex kullanılacak her antikor için en iyi pozisyon (sipariş) belirlemektir.
- Optimize antikorlar (Bölüm 1) dayalı seçim bol epitopu olan kontrol slaytlar seçin. Her yuvarlak boyama için Multiplex yapılacak, bu sayıda kontrol slaytları monoplexes oluşturmak için seçin.
- Leke monopleler.
- Her slaytlar için farklı bir sırada (pozisyon) birincil antikor kullanarak 2.1 − 2.11 bölümlerini izleyin. Her slaytta, diğer slaytlardan farklı bir sırada (pozisyon) uygulanan yalnızca bir birincil antikor olmalıdır.
Not: yuvarlak hiçbir birincil antikor veya fluorophore için çağıran her slayt Için, bunun yerine primer antikor seyreltilme ve fluorophore seyreltilme13kullanın.
- Her slaytlar için farklı bir sırada (pozisyon) birincil antikor kullanarak 2.1 − 2.11 bölümlerini izleyin. Her slaytta, diğer slaytlardan farklı bir sırada (pozisyon) uygulanan yalnızca bir birincil antikor olmalıdır.
- Görüntü slaytlar ve monoplex analiz.
- Mikroskop kullanarak ve tüm kanallar için 250 MS için pozlama süresini ayarlama odak DAPı kullanan her görüntü yakalamak.
Not: pozlama süreleri 50 − 250 MS14olarak ayarlanabilir. - Analiz yazılımını kullanarak her bir monoplex slaytı lekelenmiş işaretçinin floresan yoğunluğuna bakarak değerlendirin.
- Bu yoğunluğu arka planda karşılaştırın. Arka planda en az 5 − 10 kat daha yüksek ise, bu slaytın konumu son Multiplex 'de kullanmak için en uygun konumudur.
- Mikroskop kullanarak ve tüm kanallar için 250 MS için pozlama süresini ayarlama odak DAPı kullanan her görüntü yakalamak.
- Multiplex için slaytlar seçin.
- İlgi slaytlarını seçin ve boyama ve görüntülemeden sonra otofloresans çıkarma için boş bir slayt olarak kullanılmak üzere ekstra bir slayt ekleyin.
- Multiplex leke.
- Monoplex sonuçlara dayanarak, adım 3.5.3 dayalı her antikor için uygun sırayı (pozisyonlar) seçin. Her fluorophore bir antikor atayın.
Not: Bu optimizasyon gerekebilir; Ancak, daha az bol işaretçileri için parlak antikorlar kullanmayı planlıyoruz1, Co-yerelleştirme antikorları birbirlerinden en spektrumları fluorophores ile eşleşmelidir13, ve spektrumlu fluorophores 540 ve 570 Co-lokalize nedeniyle olmamalıdır Spektral çakışma sorunları1. - 2.1 − 2.11 bölümlerle devam edin, boş slaytın primer antikor, fluorophore veya DAPı almaması yerine, sırasıyla antikor seyreltici, fluorophore seyreltilmesi ve TBST kullanın.
- Monoplex sonuçlara dayanarak, adım 3.5.3 dayalı her antikor için uygun sırayı (pozisyonlar) seçin. Her fluorophore bir antikor atayın.
- Görüntü Multiplex ve boyama bütünlüğü için analiz
- Mikroskop kullanarak ve tüm kanallar için 250 MS için pozlama süresini ayarlama, odaklanmak için DAPı kullanan her görüntüyü yakalamak.
- Analiz yazılımını (malzeme tablosu) kullanarak, her bir Multiplex 'i floresan yanlış renkle değerlendirin.
Not: net bir görüntü her Marker açıkça göstermelidir. Bir işaretçi differe ve grenli görünüyorsa veya varolmayan, işaretçinin işe yaramadı ve yeniden optimize edilmesi gerekir muhtemeldir. - Analiz yazılımını kullanarak her bir Multiplex 'i patoloji görünümüne göre değerlendir. Patoloji görünümü her işaretçinin özgüllüğünü teyit edecektir. Daha önce en iyi duruma getirilmiş ıHC karşılaştırın (Bölüm 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
7-renkli Multiplex assay alma genel süreci tekrarlayan bir desen izler. Şekil 1 , bir grafiksel formunda işlemi açıklar. Bir kez slaytlar kesilmiş ve kurutulur veya laboratuvardan alınır ve 1 h için 60 °c ' de bir hibridizasyon fırında pişmiş, daha sonra deparafinizasyonda ve rehidrasyon devam, yeniden antijen alma tarafından takip formalin slaytlar düzeltin. Her yuvarlak çoğullama antikor kaldırma (Şekil 1) üzerinde antijen alma ve bitirir başlar.
Süreçteki her adımın optimizasyonu, net ve kullanışlı bir görüntü elde etmek için çok önemlidir. Antikorlar öncelikle pH 6 ve pH 9 ile antijen alma tamponları kullanarak ıHC tarafından test edilmelidir hangi antijen alma tampon en iyi bu belirli antikor ile çalışır görselleştirmek için her antikor için. Genellikle, nükleer hedefler tampon pH 9 ile antijen alımı yanıt. Örneğin, pH 9 antijen alma arabelleği pH 6 ' nın antijen alma arabelleği ile en iyi şekilde çalışan CD3 aksine kullanıldığında en iyi FOXP3 çalışır. IFC işleminden alınan görüntüler, Multiplex analizinin özgüllüğünü doğrulamak için kullanılmalıdır.
Bir monoplex Multiplex her antikor sırasını belirlemek için gereklidir. 4 veya 7 renk kiti kullanırken, her antikor dizide tercih edilen bir sıraya sahip olacaktır. Kullanılacak antikor sayısı için, uygun kontrol slaytlarını (örneğin, bir rengin DAPI olduğu 7 renk Multiplex için, 6 diğer fluorophores için 6 doku özel temsilcisi kontrol slaytları) toplayın. Şekil 2 A-C ffpe kolon kanseri dokusu ile 3 slaytlar kullanarak bir monoplex tahlil bir şematik temsilidir. Her slayt FOXP3 fluorophore 570 kullanarak dizide farklı bir konumda vardır. DAPı yeterli çekirdekleri görselleştirmek için bir sayaç leke olarak kullanılır. Şekil 3' te, bir monoplex ve farklı FOXP3 pozisyonlu bir Multiplex temsili görüntüler gösterilir. Şekil 3A, B nerede FOXP3 üçüncü pozisyonda ( Şekil 2Cgösterilen SIPARIŞE karşılık gelen), FOXP3 (kırmızı) belirli ve sağlam boyama parlak nükleer boyama Şekil 3A ve Co-yerelleştirme tarafından gösterildiği gibi görülür CD3 Şekil 3Bile. Fluorophore sinyal yoğunluğu başka bir yerde doku Şekil 3Aiçinde nonspesifik boyama olmadan FOXP3 özgüllüğü doğrular. Şekil 3c'de, burada FOXP3 ilk pozisyonda ( Şekil 2asırasına KARŞıLıK gelen), FOXP3 özel olmayan boyama vardır. Kırmızı kapağın Grainy differe alanları bu alanlarda slayt ve floresan yoğunluğu çoğu 1 ' den az. Benzer bir sonucu boyama sonuçlarının sırasını test etmek için bir monoplex ilk tamamlanmadan bir Multiplex yapmaya çalışıyor ve reaktifler atık olacaktır. Multiplex işlemde gözden olamaz başka bir kritik adım DAPı boyama olduğunu. Çalışma DAPI karşıt analiz yazılımı kullanarak hücre tanımlaması ve daha uzamsal analiz için temelidir. Bileşik görüntüde Şekil 3E 'de çalışma DAPI (mavi) ve Şekil 3F'deki çalışma dışı DAPI ile önemli bir kontrast görülebilir. Şekil 3F 'deki görüntü, analiz yazılımında hücreleri tanımlamak için kullanılamaz. Bir girişim Multiplex ve doku analizi kurtarma, lamel magazini belki tbst içinde bir mikrosallama adım pH 6 antijeni alma tampon DAPI ek bir uygulama ile ardından slayt ilikleyerek kaldırıldı.
Monoplex tahlil tamamlandı ve optimum antikor sipariş teyit edildikten sonra, Multiplex bir strateji Şekil 4inşa edilebilir. Her hedef için farklı bir fluorophore seçilmelidir. Her fluorophore ile ilişkili sayı kabaca uyarma sonra yayılan spektral floresan dalga boyu temsil eder, akış sitometri benzer. Spektral örtüşme ve belirteçleri potansiyel kanama sınırlamak için fluorophores ile önerilen antikorlar eşleştirirken bakım alınmalıdır. İyi bir strateji, bir net görüntü ve daha güvenilir fenotipleme13sağlayan aşırı spektral çakışmayı azaltmak için ortak yerelleştirme antikorlar için birbirlerinden uzak dalga boyu seçmek için. Örneğin, görüntülenen Multiplex strateji (Şekil 4), CD8 fluorophore 570 ile EŞLEŞTIRILMIŞ iken CD3 fluorophore 520 ile eşleştirilir. Bir fluorophore 540 ve 570 ortak lokalize hedefler olarak bu en ayırt edici olmak eğilimindedir ve sonuçları zarar verebilir kullanımından kaçınılmalıdır. Fluorophore 620 çok parlak olmak eğilimindedir ve doku bol olmayan antikorlar için kullanılmalıdır. Her fluorophore için bir referans olarak kullanılan yeni bir kütüphane de fluorophores spektral çakışmayı azaltarak yardımcı olur. Tüm antijen alımı yuvarlar boş bir slayt bileşik görüntüden otofloresans ekstraksiyon sağlamak için gereklidir. Bu boş slayt, çalışma primer antikor ve fluorophore yerine Multiplex slaytlar ile aynı tedavi geçmesi, antikor seyreltilme ve fluorophore seyreltilmesi sırasıyla Şekil 4bkullanılacaktır.
Multiplex tasarım düzgün çalıştı ve bileşik görüntüde görülen işaretçileri emin olmak için, daha sonra olabilir bir faux ıHC görüntü oluşturur mikroskop yazılımı kullanarak "Brightfield" ayar seçeneği ile birlikte "patoloji görüntü" kullanın Bölüm 1 ' de tartışılan önceki ıHC ile karşılaştırıldığında. Ne yazık ki, güzel kompozit görüntüler mutlaka doğru bir leke yansıtmayabilir ve bu kalite kontrol sürecini önemli bir adımdır ve yanlış olumlu sonuçları önlemek. Şekil 5A ilk endişesi olmadan bileşik bir görüntü gösterir. CD3 görselleştirildi ve belirli boyama (yeşil) gösterir ve Şekil 5Bpatoloji aydınlık alan görüntü tarafından teyit edilir. CD163 (turuncu) kompozit resimde görülür (Şekil 5A); Ancak, CD163 (Şekil 5c) patoloji aydınlık alan görünümünü değerlendirirken, antikor nonspecific. Özel boyama ile en iyi Multiplex görüntünün bir örneği, bileşik bir görüntüde (Şekil 5D) gösterilmektedir. CD3 ve CD163 özgüllüğü patoloji aydınlık alan görünümü kullanılarak teyit edilir (Şekil 5e ve Şekil 5F, sırasıyla) ve bu antikorlar (gösterilmez) kullanılarak gerçekleştirilen önceki IFC deneyleri olumlu karşılaştırır.
Şekil 1: boyama iş akışı diyagramı.
Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Monoplex geliştirme.
(A) POZISYON 1 FOXP3 ile kolon kanseri slayt. (B) pozisyonda FOXP3 ile kolon kanseri slayt 2. (C) POZISYONUNDA FOXP3 ile kolon kanseri slayt 3. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: tek katlı ve Multiplex başarıları ve tuzakları.
(A) FOXP3 ile primer kolon kanseri monoplex tahlil konumunda 3, floresan yoğunluk etiketi gösterilir. (B) FOXP3 ile primer kolon kanseri Multiplex assay konumunda 3 ve CD3 konumunda 2. (C) FOXP3 ile primer kolon kanseri monoplex tahlil konumunda 1, floresan yoğunluk etiketi gösterilir. (D) FOXP3 ile primer kolon kanseri Multiplex assay konumunda 1 ve CD3 konumunda 2. (E) aşağıdaki gibi antikorların sırası ile primer kolon kanseri Multiplex ASSAY: CD8 (sarı), CD3 (yeşil), CD163 (turuncu), pancytokeratin (beyaz), PD-L1 (macenta), FOXP3 (kırmızı), çalışma DAPI (mavi). (F) aşağıdaki gibi antikorların sırası ile primer kolon kanseri Multiplex ASSAY: CD8 (sarı), CD3 (yeşil), CD163 (turuncu), pancytokeratin (beyaz), PD-L1 (macenta), FOXP3 (kırmızı), non-WORKING DAPI (mavi). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Multiplex geliştirme.
(A) 7 renkli Multiplex kolon kanseri Multiplex Slide. (B) 7 renkli Multiplex kolon kanseri dokusu kullanarak boş slayt. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5:7 renkli Multiplex 'in özgüllüğü analiz ediliyor.
(A) aşağıdaki gibi antikorlar ile Multiplex kompozit görüntü: CD8 (sarı), CD3 (yeşil), CD163 (turuncu), pancytokeratin (beyaz), Ki67 (kırmızı), DAPI (mavi). (B) sadece CD3 görünümünde panelde görüntü patoloji aydınlık alan görünümü. (C) CD163 sadece görünümünde panelde görüntü patoloji aydınlık alan görünümü. (D) antikorlar ile Multiplex kompozit görüntü aşağıdaki gıbıdır: CD8 (sarı), CD3 (yeşil), CD163 (turuncu), pancytokeratin (beyaz), PD-L1 (macenta), FOXP3 (kırmızı), DAPI (mavi). (E) sadece CD3 görünümü üzerinde panel D görüntü patoloji aydınlık alan görünümü. (F) CD163 sadece görünümü üzerinde panelde görüntünün patoloji aydınlık alan görünümü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Katı tümör biyopsisi ve cerrahi rezeksiyondan gelen bozulmamış doku örnekleri, hasta prognoz yanı sıra hastalık analizi için önemli tanı ve öngörü araçları olarak kalır. Multiplex floresan immünhistokimya (mfIHC), immünhistokimya (ıHC), immünofluoresesans (IF) ve akış sitometri avantajlarını birleştiren yeni bir tekniktir. Bir doku ortamında hücre-hücre düzenlemeleri değerlendirilmesi için izin var situ hücre prob önceki yöntemleri8, ancak, probed olabilir epitenler düşük sayıda karmaşık analiz sınırlar. Akış sitometri, bir örnekdeki birçok hücre türünü analiz etmek yararlı olsa da, tek hücreli süspansiyon olarak numune hazırlama nedeniyle uzamsal bağlamı kaybeder9,10. mfihc, hücresel mikroortamın uzamsal bağlamını koruyarak ve etiketli epitopu11' in sinyalini yükselterek etiketlenebilir epitopiler sayısını artırarak bu teknikleri köprüler. Önceki araştırmalar kanser ve non-Cancer doku numuneler1,2,3,4,5,15hücresel sızmak fenotiplemeyi için mfihc kullandı. Görüntü sonrası analiz Ayrıca doku mikroortamı1,2,4içindeki hücrelerin ve yapıların uzamsal ilişkilerini çözümlemek için de kullanılmıştır. Güvenilir analiz için, belirli ve doğru bir görüntü önce üretilmelidir. Otomatik boyama sisteminin aksine manuel boyama tekniği, bu teknolojiye daha küçük ve maliyetten bilinçli laboratuvarlara erişim sağlar. Optimizasyon süresi ve boyama süresi, daha fazla uzamsal analizler için güvenilir bir görüntü elde etmenin en büyük engelleri arasındadır.
Birçok genel kurallar başarılı nesil güvenilir bir bileşik Multiplex görüntü olasılığını artırmak ve zaman ve kaynakları tasarruf edecektir. Multiplex kullanılan antikorlar manuel konvansiyonel ıHC ile başarıya göre seçilmelidir. PH 6 ve pH 9 ile Antigen Alma arabellekleri, Multiplex kullanım için uygun antijen alımı araştırmak için ıHC için kullanılmalıdır. Monoplex geliştirme çoğullama protokol içinde antikorların yerleşimini belirlemek için gereklidir. Bunun mantık karmaşık ve doku örnekleri ve epitopes arasında değişir. Bazı durumlarda, epitopu birden fazla mikro sallama adımları ile düşebilir ve marker görselleştirme kaybolur, genellikle CD3 ile durumda olduğu gibi. FOXP3, ancak, daha fazla mikrosallama adımları ile parlak hale gelir ve Multiplex13,14ilk veya ikinci turda yerleştirilirse ancak görülebilir.
Boyama işlemi, şarj edilmiş slaytlar üzerine FFPE dokusu kesilmiş olarak başlar. Karşılaşılabilecek ilk sorun, mikrosallama sonrası slayttan düşen dokudur. Şarj edilen slaytlar kullanılmaz, cam yüzeye doku yapışmaları sınırlıdır ve doku ya aşırı katlama veya tamamen kapalı slayt olabilir. Boyama işlemi sırasında dokuların slaytlara yapışmaları için daha fazla emin olmak için çeşitli teknikler gerçekleştirilir. İlk kez slaytlar üzerine blokları kesme, su en saf formu iyi çalışır. Bazı laboratuvarlar için, deiyonize su yeterli olabilir ama damıtılmış su en iyi çalıştı. 37 °C ' de gece kesildikten hemen sonra slaytlar düz olarak kurutulmalıdır. Daha fazla uyum sağlamak için, slaytlar daha sonra bir hibridizasyon fırın yerleştirilir ve pişmiş düz 60 °c ' de bir saat önce kullanım için yatıyor. İlk doku hazırlama sürecinde formalin fiktasyonu zaten oluşsa da, deparafinizasyonda ve rehidrasyon işleminden sonra 30 dakika boyunca nötr tamponlu formalin içinde slaytlar yerleştirilmesi, monte edilen doku1,13.
Manuel boyama işlemi, kullanılan antikorların sayısına bağlı olarak üç, 8 saatlik gün kadar sürebilir. Tuzaklardan kaçınmak zaman ve koruyucu reaktiflerin tasarrufunda esastır. İlk ortak hata genellikle reakajın hazırlanmasında gerçekleşir. Su laboratuvarlar arasında farklıdır ve bir laboratuvardan diğerine sonuçları tek bir fark olabilir. Tüm reaksiyonlar ve reaktifler için aynı yanı sıra temiz bir su kaynağı kullanarak tutarlı bir sonuç sağlar. Antikorlar, engelleme solüsyonu ve fluorophores oda sıcaklığında en iyi şekilde çalışır. Reaktif ve çalışma çözeltisi preparatında tuzaklar önlemek için, tüm reaktifler için aynı suyu kullanın. Ayrıca oda sıcaklığında tüm çalışma çözümleri ve reaktifler kullanın.
MfIHC sorun giderme önemli ve sıkı laboratuvar kurallarına bağlılık bileşenleri ve/veya operatör hatası kontaminasyonu sınırlamak için önemlidir. Suboptimal görüntülerin üretimi sonuçları eğriltme ve verileri olumsuz yönde etkileyebilir yanlış pozitif ve negatif hücre nüfus yol açacaktır. Nihai analiz genellikle makine öğrenmeye dayalı bilgisayar tarafından oluşturulan fenotipleri içerdiğinden, boyama küçük hatalar tüm veri kümesini etkilemek için büyütülmüş olabilir. Örneğin, tüm lekeleri mükemmel çalışabilir, ancak bir hata veya DAPı ihmal gelecekteki hücre segmentasyonu önlemek ve deneme yararsız render sayma. Analiz yazılımı yalnızca hücreleri tanımlamak için değil, yalnızca x ve y koordinatlarını her hücreye atar ve Multiplex loş, kötü şekilde belirsiz veya differe DAPı boyama varsa, görüntü daha fazla kullanılamaz ve Multiplex redone veya denenmelidir DAPı boyama kullanır kurtarma ve yeniden DAPı boyama. Patoloji ve aydınlık alan views gibi yazılım bileşenlerinin kullanımı, optimizasyon sürecinin başlarında duyarlılık ve özgüllüğe olan güveni arttıracak ve Multiplex süreçte erken hataları önlemektir.
Görüntüleme sürecinin değiştirme yönleri de görüntü optimizasyonu yardımcı olabilir. Örneğin, odak için görsel yardım olarak DAPı kullanarak bir görüntü alarak bulanıklaşan görüntüleri önlemek için yardımcı olur. Yeni yapılmış fluorophore Kütüphane yazılım ekleme temiz bir görüntü ve her fluorophore analiz aşamasında daha az spektral örtüşme sağlamak ve otofloresans ayıklamak için boş slayt kullanarak belirteçler yoğunlaştırır ve görüntü geliştirir Kalite.
Doku örneklerinin kullanımı hastalığın patofizyolojisini araştırırken temel bir araç olarak kalır ve olacaktır. Gelişmekte olan teknoloji hücre-hücre etkileşimleri bizim anlayış arttı ve mfIHC umut verici bir yeni oyuncu. Bu teknikte boyama işlemi sırasında optimizasyon ve doğruluk, hücre-hücre etkileşimlerinin uygun kullanımı ve daha fazla analizi için önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Perkin Elmer daha önce Ed Stack teşekkür etmek istiyorum, kurulum ve orijinal Multiplex boyama optimizasyonu ile onun yardımı için. Yazarlar da analiz yazılımı kullanarak ipuçları için Akoya Biosciences gelen Kristen Schmidt teşekkür etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Kanser Sağlık Enstitüleri tarafından ödül numarası P30CA046592, K08CA201581 (TLF), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (MPM), RSG1417301CSM (MPM), R01CA19807403 (MPM), U01CA22414501 (MPM, HC) altında desteklenmektedir. CA170568 (HC). İçerik sadece yazarlar sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez. Ek destek Jeffery A. Colby Colon Cancer ve Tom Liu Memorial araştırma fonları tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
- Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
- Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Phenoptics Research Solutions. Perkin Elmer Manual. , 32 (2016).
- Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , Perkin Elmer Manual. (2014).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
