Summary
Multiplex флуоресцентной иммуногистохимии является новой технологией, которая позволяет визуализации нескольких типов клеток в нетронутой формалин фиксированной, парафин встроенных (FFPE) ткани. Представлены руководящие принципы для обеспечения успешного 7-цветного мультиплекса с инструкциями по оптимизации антител и реагентов, подготовке слайдов, дизайна и советов для избежания общих проблем.
Abstract
Оценка микроокружения нетронутой ткани для анализа инфильтрации клеток и пространственной организации имеет важное значение для понимания сложности процессов заболевания. Принцип методы, используемые в прошлом включают иммуногистохимии (IHC) и иммунофлуоресценции (ИФ), которые позволяют визуализации клеток в качестве снимка во времени, используя между 1 и 4 маркеров. Оба метода имеют недостатки, включая трудности с окрашиванием плохо антигенных целей и ограничения, связанные с реактивностью кросс-видов. IHC является надежным и воспроизводимым, но характер химии и опоры на спектр видимого света позволяет использовать лишь несколько маркеров и затрудняет локализацию. Использование IF расширяет потенциальные маркеры, но обычно полагается на замороженные ткани из-за обширной аутофлуоресценции тканей после фиксации формалина. Цитометрия потока, метод, который позволяет одновременное обозначение нескольких эпитопов, отменяет многие недостатки IF и IHC, однако, необходимость изучения клеток, как одна суспензия клеток теряет пространственный контекст клеток отбрасывая важные биологические Отношения. Multiplex флуоресцентной иммуногистохимии (mfIHC) мосты эти технологии, позволяющие мульти-эпитоп клеточного фенотипирования в форминале фиксированной парафин встроенных (FFPE) ткани при сохранении общей архитектуры микросреды и пространственной отношения клеток в нетронутой ненарушенной ткани. Высокофюмиорная интенсивность флюорофоров, которые ковалентно связи с эпитопом ткани позволяет несколько применений первичных антител, не беспокоясь видов конкретных кросс-реактивность вторичных антител. Хотя эта технология была доказана для получения надежных и точных изображений для изучения болезни, процесс создания полезной стратегии mfIHC окрашивания может быть трудоемким и требовательным из-за обширной оптимизации и дизайна. Для того, чтобы сделать надежные изображения, которые представляют точные клеточные взаимодействия на месте и смягчить период оптимизации для ручного анализа, представленные здесь методы подготовки слайда, оптимизация антител, мультиплекс дизайн, а также ошибки часто встречаются во время процесса окрашивания.
Introduction
Визуализация нетронутой микросреды опухоли (TME) имеет важное значение в оценке не только клеточной инфильтрации в твердых злокачественных новообразований, но и клеточных взаимодействий. Мультиплекс флуоресцентной иммуногистохимии (mfIHC) стал эффективным инструментом для мультиантигена фенотипирования клеток в исследовании рака и связанных с ними заболеваний1,2,3,4, 5,6,7. Это, в сочетании с новым программным обеспечением и программами,предназначенными для анализа больших наборов данных, позволяет наблюдать за сложными взаимодействиями между ячейками 1,2,4. Коэффициентом ограничения скорости при получении данных часто является качество окрашенных тканей до анализа.
Предыдущие методы, используемые для фенотипных клеток в TME включают иммуногистохимию (IHC), иммунофлуоресценцию (ИФ) и цитометрию потока, все из которых представляют значительные ограничения. IHC использует формалин фиксированной парафин встроенных (FFPE) ткани разделы, которые депарафинизированы и регидратированных до того, окрашенные чаще всего одно антитела. Использование хрена пероксидазы (HRP) связаны вторичные антитела и химической реакции позволяет визуализации одного антигенного эпитопа8. В то время как IHC является надежным и выполняется на ткани FFPE, с которой легко работать, ограничения видимого спектра света означают, что только один или два маркера могут быть надежными различимыми и колокализации антигенов довольно трудно8. Способ расширить доступные маркеры и, следовательно, антигены, которые могут быть исследованы на одном разделе, чтобы изменить на флуоресценцию, которая позволяет использовать более широкий спектр визуального спектра. Для IF, замороженные или FFPE ткани переносится на слайды и антитела, используемые, которые спрягаются с различными флюорофорами. Хотя это увеличивает количество антигенов, которые могут быть проверены, Есть несколько важных ограничений. Во-первых, потому что каждое антитело обычно имеет только один флюорофор прилагается, яркость часто не достаточно сильны, чтобы преодолеть аутофлуоресценции тканей. Именно по этой причине, большинство IF выполняется на замороженных тканей, которые дорого хранить и трудно работать. Ограниченное количество флуоресцентных меток доступны для использования из-за спектрального перекрытия и перекрестной реактивности видов, особенно при использовании неконъюгированных антител. Поток цитометрии, которая состоит из обработки свежей ткани в одну клетку подвески и маркировки флуоресцентными антителами был золотым стандартом для иммунофенотипирования на протяжении десятилетий9,10. Преимуществоциетрии потока является способность маркировать несколько антител без заботы о поперечной реактивности видов, поскольку большинство из них спряженные. Потому что клетки "визуализированы" машиной, а не человеческие глаза, Есть гораздо больше фторофоров доступны, но это поставляется с затратами. Компенсация должна производиться вручную, что может существенно изменить результаты, приносящие ложноположительные и отрицательные результаты. Наиболее значительным ограничением цитометрии потока является то, что архитектура тканей и впоследствии вся пространственная информация теряется из-за необходимости подвески одиночных клеток.
Мультиплекс флуоресцентной иммуногистохимии (mfIHC) с использованием автоматизированного флуоресцентного микроскопа в сочетании с новым программным обеспечением сочетает в себе преимущества IHC, IF и цитометрии потока, позволяя мульти-антигенной ткани окрашивания с усиливанием сигнала и сохранение пространственных отношений без необходимости компенсации. Ткань FFPE помещается на заряженные слайды, которые после поиска антигена, проходят раунд первичного применения антител к целевому антигену интереса, а затем вторичное антитело с химическим тегом HRP, похожим на IHC. После размещения вторичного антитела, СПЕЦИФИЧЕСКая реакция HRP приводит к флюорофору ковалентно связывая с эпитопом интереса11. После того, как ткань помечена, еще один раунд нагрева слайдов завершается удаление ранее прикладного первичного и вторичного комплекса антител, оставляя только флуоресцентный тег, привязанный к эпитопу ткани11. Это позволяет использовать несколько антител любого вида без опасений за перекрестную реактивность11,12. Чтобы свести к минимуму необходимость ручной компенсации нескольких флуоресцентных красителей, коллекция флюорофоров с небольшим спектральным перекрытием, включая ядерное пятно счетчика используется для завершения mfIHC. Для учета автофлюоресценции, встречающейся с тканью FFPE, программное обеспечение вычитает автофлюоресценцию из конечного изображения, используя изображение с пустого слайда, что возможно из-за силы антигена специфической флуоресценции после флюорофора усиление сигнала. Используя новые программы, предназначенные для больших наборов данных,расположение ячеек можно определить и проанализировать для пространственного контекста 1,2,4. Наиболее значительным ограничением этого метода является время оптимизации. Здесь найдена подробная методология с инструкциями по экспериментальному проектированию и стратегии окрашивания и визуализации. mfIHC будет полезен для лабораторий, которые в настоящее время не имеют оптимизированной автоматизированной системы окрашивания, которая хотела бы лучше понять пространственный контекст взаимодействия между клетками и клетками в нетронутой ткани FFPE с помощью ручной техники.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Вся работа была одобрена внутренним наблюдательным советом Мичиганского университета.
1. Оптимизация первичных антител и скольжение
- Определите идеальную концентрацию антител для мультиплекса с помощью обычного IHC.
- Тест антитела для мультиплекса с помощью ручной обычной иммуногистохимии (IHC)13.
- Используйте специфические ткани которые имеют обильный тип клетки для каждого испытанного антитела such as использование ткани миндалин для испытания антител CD3.
- Используйте эталонную концентрацию для IHC, рекомендованную компанией, а затем заполните IHC с концентрацией антител в рекомендуемых концентрациях, а также концентрациями выше и ниже рекомендуемой концентрации.
- Подготовка формилина фиксированной парафин встроенной ткани на слайды.
- Используя микротом, вырезать блоки ткани FFPE толщиной между 4 и 6 мкм и применять к заряженным слайдам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование дистиллированной воды обеспечивает надлежащее монтаж ткани и присоединение во всем мультиплексе. - Поместите слайды плоские, ткани вверх, и дайте высохнуть при 37 градусах Цельсия на ночь.
- Храните слайды в слайд-поле от экстремальной температуры до готовности к завершению мультиплекса.
- Используя микротом, вырезать блоки ткани FFPE толщиной между 4 и 6 мкм и применять к заряженным слайдам.
2. Общий метод окрашивания
- Приготовление растворов для мытья и извлечения антигенов
- Подготовьте раствор для мытья 0,1% TBST путем смешивания 9 л деионизированной воды, 1 л буферизированного солей (TBS) и 10 мл полисорбата 20.
- Подготовьте оба решения для извлечения антигена (pH 6 и pH 9; Таблица материалов) путем разбавления до 1x с деионизированной водой.
- Депараффинизация и регидратация
- Выпекать слайды, лежа плашмя, ткань вверх при температуре 60 градусов по Цельсию на 1 ч в духовке гибридизации1. Удалите слайды из духовки и дайте остыть, по крайней мере, 5-10 минут, а затем поместите в вертикальную стойку слайда.
- Лечить слайды в следующих решениях последовательно: ксилен в тройник, а затем одно лечение 100% этанола, 95% этанола, и, наконец, 70% этанола в течение 10 минут каждый с помощью слайда окрашивающий набор1.
- Вымойте стойку слайдов в течение 2 минут с деионизированной водой путем погружения в пластиковой коробке слайд с последующим фиксацией путем погружения в пластиковую поле слайд заполнены нейтральным буферизированным формалином в течение 30 мин13. Вымойте горки в деионизированной воде в течение 2 минут, а затем перейти к антигена поиска.
- Извлечение антигена
- Поместите стойку слайдов в термостойкую коробку, заполненную внутренней линией (примерно 300 мл) с pH 6 или pH 9 буфером поиска антигена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Антиген поиска буферможет быть либо рН 6 или рН 9, которые, возможно, потребуется оптимизировать на эпитоп. Однако, начните с использования рН 9 для антител, которые связываются с ядерными эпитопами и рН 6 для всех других антител. - Обложка коробки с полиэтиленовой пленкой и использовать резинку для обеспечения. Поместите коробку в микроволновую печь на краю вращающейся пластины (микроволновка должна быть оснащена инверторной технологией даже для нагрева). Нагрейте горки для 45 s на 100% силе последовано за 15 min на 20% силе13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроволновая обработка может нуждаться в оптимизации в зависимости от используемой микроволновой печи. - Пусть слайды остыть в течение примерно 15-20 минут.
- Поместите стойку слайдов в термостойкую коробку, заполненную внутренней линией (примерно 300 мл) с pH 6 или pH 9 буфером поиска антигена.
- Подготовьте рабочие растворы антител и флюорофоров, в то время как горки охлаждают.
- Подготовка первичного антитела разбавлять путем растворения 0,5 г крупного рогатого скота сывороточный гранулы в 50 мл TBST. Кроме того, используйте 50 мл 1x фосфат буферного солей (PBS) для растворения гранул.
- Сделайте каждое первичное антитело рабочим раствором оптимизированной концентрации, определяемой в разделе 1, в первичном разбавителе антител. Оцените примерно 200 л л на слайд.
- Подготовьте фторфор рабочего раствора, разбавляя каждый фторфор в разбавителе фторорора в концентрации 1:100.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может потребоваться оптимизировать в зависимости от антитела. Оцените примерно 100 л л на слайд. - В последний день окрашивания, подготовить 4 ",6-диамидино-2-фенилиндинол (DAPI) рабочее решение, добавив 3 капли DAPI в 1 мл TBST.
- Слайд окрашивания (мытье и блокирование)
- Снимите коробку из микроволновой печи после охлаждения и снимите полиэтиленовую пленку, промойте горки деионизированной водой в течение 2 минут, а затем 2 мин мыть в пластиковой коробке слайд заполнены TBST13.
- После сушки каждого слайда вокруг ткани с деликатной задачей протрите осторожны, чтобы не дать ткани высохнуть, след вокруг внешней ткани с помощью гидрофобной барьерной ручкой. Не прикасайтесь к ткани с деликатной задачей протрите или ручкой.
- Поместите каждый слайд в увлажненной камере и добавьте блокирующий раствор (примерно 4 капли) в ткань. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре (RT).
- Слайд окрашивания (первичное применение антител)
- Возьмите каждый слайд и удалить блокирующее решение, нажав сторону слайда на стопку бумажных полотенец и с помощью деликатной задачи протрите, чтобы удалить избыток блокирующего агента со всей ткани.
- Положите слайд обратно в увлажненную камеру и добавить около 200 л рабочих первичных антител. Инкубировать в увлажненной камере за 1 ч на RT.
- Вымойте с TBST в течение 2 мин путем погружения в тройной13.
ПРИМЕЧАНИЕ: После каждого шага стирки изменение TBST поможет обеспечить более чистое изображение.
- Слайд окрашивания (вторичное применение антител)
- Dab от остальных TBST от каждого слайда и применять примерно от 3 до 4 капель вторичного антитела (смесь кролика и мыши вторичных HRP спряжение антител). Инкубировать в течение 10 минут в увлажненной камере на RT13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если планируетиспользовать первичное антитело, которое требует вторичного антитела, кроме мыши или кролика или выбирая использовать альтернативные вторичные антитела, примените соответствующие HRP конъюгированные вторичные горки и инкубировать на RT в течение 45 мин. Оптимизация инкубационного времени может потребоваться для альтернативных вторичных14. - После инкубации, мыть с TBST в течение 2 мин в тройной13.
- Dab от остальных TBST от каждого слайда и применять примерно от 3 до 4 капель вторичного антитела (смесь кролика и мыши вторичных HRP спряжение антител). Инкубировать в течение 10 минут в увлажненной камере на RT13.
- Слайд окрашивания (фторофор ассору)
- Нанесите примерно 100 л из фторофора рабочего раствора и инкубировать в увлажненной камере на RT в течение 10 мин13.
- Вымойте с TBST в течение 2 минут в тройной13.
- Удаление антител
- Микроволновые слайды (45 с на 100%, а затем 15 мин на 20%) в термостойкой коробке (см. шаг 2.3.2) для удаления антител13,14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это завершает один раунд мультиплекса. Это единственный момент, в котором протокол может быть приостановлен. Чтобы приостановить протокол, оставьте слайды погруженными в буфер поиска антигена на ночь при комнатной температуре.
- Микроволновые слайды (45 с на 100%, а затем 15 мин на 20%) в термостойкой коробке (см. шаг 2.3.2) для удаления антител13,14.
- Продолжить дополнительные раунды окрашивания. Повторите шаги 2.5.1-2.9.1 для остальных пар антител-фторфора. После того, как все антитела и фторофоры были использованы, перейти к разделу 2.11.
- Приложение DAPI и монтаж
- После последнего раунда окрашивания в мультиплексе, удалить последнее применение антител с антигеном поиска раствора рН 613. Вымойте с deionized водой последовано за TBST для 2 min каждые13.
- Нанесите примерно 150 л рабочего раствора DAPI на слайды и инкубировать в увлажненной камере в течение 10 минут на RT1.
- Вымойте tBST в течение примерно 30 с и монтировать крышки с антифадейс-монтажом. Применить прозрачный лак ногтя на четырех углах coverslip раз монтаж амсредствашки высохли, чтобы обеспечить coverslip (по желанию).
3. Подробная информация для библиотеки, моноплексов и мультиплексов
- Выберите слайды для создания библиотеки флюорофоров.
- Для 7-цветного мультиплекса собрать 7 иммунных клеток богатых тканей слайдов (т.е., миндалины, селезенки и т.д.) для библиотеки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите слайды управления, которые будут использоваться для библиотеки фторфора с каждым слайдом, представляющим каждый уникальный флюорофор, который будет использоваться в мультиплексе. Контроль ные горки должны иметь обильный эпитоп выбора и может быть тот же тип ткани для каждого фторофора.
- Для 7-цветного мультиплекса собрать 7 иммунных клеток богатых тканей слайдов (т.е., миндалины, селезенки и т.д.) для библиотеки.
- Пятно и изображения библиотеки слайды для использования с моноплексами и мультиплексами.
- Выполните шаги 2.1'2.9.1, используя контрольные слайды и слайды управления тканью по выбору. Поместите различные флюорофоры на каждом слайде в концентрации 1:100; один слайд должен содержать только DAPI.
- Приступить к разделу 2.11, за исключением опустить DAPI окрашивания и вместо этого использовать TBST и горе, как описано.
- После сдачи слайдов сухой ночь, изображение со всеми каналами DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas Red, полупроводниковые квантовые точки, и флуоресцент изотиоциана (FITC) установка воздействия 250 мс с функцией защиты насыщения1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции может быть установлено на уровне 50–250 мс13. - Загрузите библиотечные изображения на программное обеспечение и используйте при анализе моноплексов и мультиплексов.
- Выберите слайды для монопрексов.
- Выберите слайды управления, которые имеют обильный эпитоп выбора на основе оптимизированных антител (раздел 1). Для каждого раунда окрашивания, чтобы быть сделано в мультиплексе, выберите это количество слайдов управления для создания моноплексов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель моноплекса состоит в том, чтобы определить наилучшее положение (заказ) для каждого антитела, которые будут использоваться в мультиплексе.
- Выберите слайды управления, которые имеют обильный эпитоп выбора на основе оптимизированных антител (раздел 1). Для каждого раунда окрашивания, чтобы быть сделано в мультиплексе, выберите это количество слайдов управления для создания моноплексов.
- Пятно монопрекс.
- Следуйте разделам 2.1–2.11 с использованием первичного антитела в разном порядке (позиции) для каждого из слайдов. Каждый слайд должен иметь только одно первичное антитело, примененное в порядке (позиции), отличаящемся от других слайдов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого слайда, где круглые требует не первичного антитела или фторфора, вместо этого использовать первичные антитела разбавителя и флюорофора разбавителя13.
- Следуйте разделам 2.1–2.11 с использованием первичного антитела в разном порядке (позиции) для каждого из слайдов. Каждый слайд должен иметь только одно первичное антитело, примененное в порядке (позиции), отличаящемся от других слайдов.
- Изображение слайды и анализ монопрекс.
- Использование микроскопа и установка времени экспозиции до 250 мс для всех каналов захвата каждого изображения с использованием DAPI для фокусировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции может быть установлено на уровне 50–250 мс14. - С помощью анализа программное обеспечение оценить каждый монопрекс слайд, глядя на флуоресцентные интенсивности окрашенных маркера.
- Сравните эту интенсивность с фоном. Если он по крайней мере в 5–10 раз выше фона, положение этого слайда является оптимальным положением для использования в конечном мультиплексе.
- Использование микроскопа и установка времени экспозиции до 250 мс для всех каналов захвата каждого изображения с использованием DAPI для фокусировки.
- Выберите слайды для мультиплекса.
- Выберите слайды, представляющие интерес и добавьте дополнительный слайд, который будет использоваться в качестве пустого слайда для вычитания автофлюоресценции после окрашивания и визуализации.
- Пятно мультиплекс.
- На основе результатов монопрекса выберите соответствующий порядок (позиции) для каждого антитела на основе шага 3.5.3. Присвоите каждому фторофору антител.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может потребовать оптимизации; однако, план использовать яркие антителадля менее обильных маркеров 1, совместнолололоцирующих антител следует сочетать с флюорофорами на дальних спектрах друг от друга13,и фторофоры со спектром 540 и 570 не должны быть совместно локализованы из-за к спектральным вопросам перекрытия1. - Продолжить с разделами 2.1'2.11 обеспечения пустой слайд не получает первичных антител, фторофора, или DAPI, вместо этого использовать антитела разбавитель, фторофор разбавитель, и TBST соответственно на своем месте.
- На основе результатов монопрекса выберите соответствующий порядок (позиции) для каждого антитела на основе шага 3.5.3. Присвоите каждому фторофору антител.
- Мультиплекс изображения и анализ для целостности окрашивания
- Используя микроскоп и установив время экспозиции до 250 мс для всех каналов, захваткаждого изображения, использующего DAPI для фокусировки.
- Используя программное обеспечение для анализа(Таблицаматериалов), оценить каждый мультиплекс флуоресцентным ложным цветом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Четкое изображение должно четко продемонстрировать каждый маркер. Если маркер выглядит диффузным и зернистым или не существует, вполне вероятно, что маркер не работает и нуждается в повторной оптимизации. - Используя программное обеспечение для анализа, оцените каждый мультиплекс по патологии зрения. Взгляд патологии подтвердит специфику каждого маркера. Сравните с ранее оптимизированным IHC (раздел 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общий процесс получения 7-цветного мультиплексного анализа следует повторяющийся шаблон. Рисунок 1 описывает процесс в схематической форме. После того, как слайды вырезать и высушить или получают из лаборатории и запеченные в духовке гибридизации при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 1 ч, а затем приступить к депарафинизации и регидратации, исправить слайды в формалин снова следуют антигена поиска. Каждый раунд мультиплексирования начинается с поиска антигена и заканчивается удалением антител(рисунок1).
Оптимизация каждого шага в этом процессе имеет первостепенное значение для достижения четкого и привычного образа. Антитела должны быть проверены IHC сначала с помощью антигена извлечения буферов с рН 6 и рН 9 для каждого антитела, чтобы визуализировать, какие антигена извлечения буфера лучше всего работает с этим конкретным антитела. Как правило, ядерные цели реагируют на извлечение антигена с помощью буферного рН 9. Например, FOXP3 лучше всего работает, когда используется буфер извлечения антигена pH 9 в отличие от CD3, который лучше всего работает с буфером извлечения антигена pH 6. Изображения, взятые из процесса IHC, должны использоваться для проверки специфики анализа мультиплексов.
Моноплекс необходим для определения порядка каждого антитела в мультиплексе. При использовании либо 4- или 7-цветной комплект, каждое антитело будет иметь предпочтительный порядок в массиве. Для количества антител, которые будут использоваться, соберите соответствующие слайды управления (т.е. для 7-цветного мультиплекса, где одним цветом является DAPI, выберите 6 тканей конкретных репрезентативных контрольных слайдов для 6 других флюорофоров). Рисунок 2 A-C представляет собой схематическое представление монопрекс асссея с использованием 3 слайдов с тканью рака толстой кишки FFPE. Каждый слайд имеет FOXP3 в другом положении в массиве, используя флюорофор 570 в качестве своего тега. DAPI используется в качестве встречного пятна для адекватной визуализации ядер. На рисунке 3показаны репрезентативные изображения моноплекса и мультиплекса с различной позицией FOXP3. На рисунке 3A,B, где FOXP3 находится на третьей позиции (соответствует порядку, показанному на рисунке 2C),специфическое и надежное окрашивание FOXP3 (красный) рассматривается как продемонстрированное ярким ядерным окрашиванием Рисунок 3A и совместной локализацией с CD3 Рисунок 3B. Интенсивность сигнала фторофора подтверждает специфичность FOXP3 без неспецифического окрашивания в других местах в ткани Рисунок 3A. На рисунке 3C, где FOXP3 находится на первой позиции (соответствует порядку на рисунке 2A),есть неспецифическое окрашивание FOXP3. Зернистые диффузные участки красного цвета покрывают большую часть горки и флуоресцентной интенсивности в этих областях меньше 1. Попытка сделать мультиплекс без завершения моноплекс сначала проверить порядок окрашивания приводит к аналогичному результату и будет отходов реагентов. Другим важным шагом, который нельзя упускать из виду в процессе мультиплекса, является окрашивание DAPI. Рабочий контрпятно DAPI является основой для идентификации клеток и дальнейшего пространственного анализа с использованием программного обеспечения для анализа. Важный контраст можно увидеть на композитном изображении с рабочим DAPI (синий) на рисунке 3E и в неработании DAPI на рисунке 3F. Изображение на рисунке 3F не могло быть использовано для идентификации ячеек в программном обеспечении для анализа. Попытка спасти мультиплекс и анализ тканей, coverslip может быть удалены путем замачивания слайд в TBST следуют микроволновой шаг в рН 6 антигена извлечения буфера с дополнительным применением DAPI.
После того, как моноплексный асссес завершен и подтвержден оптимальный порядок антител, можно построить стратегию мультиплекса Нарисунке 4. Для каждой цели должен быть выбран другой флюорофор. Число, связанное с каждым флюорофором, примерно представляет спектральную флуоресцентную длину волны, испускаемую после возбуждения, подобно цитометрии потока. Следует проявлять осторожность при сопоставлении предлагаемых антител с флюорофорами, чтобы ограничить спектральное перекрытие и потенциальное кровотечение маркеров. Хорошая стратегия заключается в выборе длин волн далеко друг от друга для совместной локализации антител, чтобы уменьшить избыток спектрального перекрытия обеспечивая четкое изображение и более надежный фенотипирование13. Например, в мультиплексной стратегии(рисунок4), CD8 в паре с фторофором 570, в то время как CD3 в паре с фторофором 520. Следует избегать использования фторофора 540 и 570 в совместно локализованных целей, поскольку они, как правило, наиболее недискриминационными и могут ухудшить результаты. Фторофрофор 620, как правило, очень яркий и должны использоваться для антител, которые не в изобилии в ткани. Недавняя библиотека, используемая в качестве эталона для каждого фторофора, также помогает уменьшить спектральное перекрытие фторфоров. Пустой слайд, который проходит все раунды поиска антигена, необходим для обеспечения извлечения аутфлюоресценции из композитного изображения. Этот пустой слайд будет проходить такое же лечение, как мультиплекс слайды, за исключением вместо рабочих первичных антител и фторфора, разбавитель антител и флюорофора разбавитель будет использоваться соответственно Рисунок 4B.
Для обеспечения мультиплекс дизайн работал должным образом и маркеры видели в композитном изображении являются конкретными, использовать "патологоанатом" в сочетании с "яркое поле" настройки вариант с помощью программного обеспечения микроскопа, который создает искусственное изображение IHC, который затем может быть по сравнению с предыдущими анализами IHC, обсуждаемым в разделе 1. К сожалению, красивые композитные изображения не обязательно отражают точное пятно, и это важный шаг для контроля качества процесса и предотвращения ложноположительных результатов. Рисунок 5A демонстрирует композитное изображение без первоначального беспокойства. CD3 визуализирован и показывает специфическое окрашивание (зеленый) и подтверждается патологией яркого изображения на рисунке 5B. CD163 (оранжевый) виден на композитном изображении(рисунок5A); однако, при оценке патологии яркого поля зрения CD163(Рисунок 5C), антитела неспецифические. Пример оптимального мультиплексного изображения с конкретным окрашиванием показан в композитном изображении(рисунок 5D). CD3 и CD163 специфично подтверждается с помощью патологии яркого поля зрения(Рисунок 5E и Рисунок 5F, соответственно) и выгодно сравнивает с предыдущими анализами IHC выполняется с использованием этих антител (не показано).
Рисунок 1: Диаграмма рабочего процесса.
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Развитие моноплекса.
(A) Рак толстой кишки слайд с FOXP3 на позиции 1. (B) Рак толстой кишки слайд с FOXP3 на позиции 2. (C) Рак толстой кишки слайд с FOXP3 на позиции 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Успехи и подводные камни моноплекса и мультиплекса.
(A) Monoplex асссе первичного рака толстой кишки с FOXP3 на позиции 3, флуоресцентные этикетки интенсивности показано. (B) Multiplex асссипервичного рака толстой кишки с FOXP3 на позиции 3 и CD3 в позиции 2. (C) Monoplex ассси первичного рака толстой кишки с FOXP3 на позиции 1, флуоресцентные этикетки интенсивности показано. (D) Multiplex ассси первичного рака толстой кишки с FOXP3 на позиции 1 и CD3 на позиции 2. (E) Мультиплекс асссис первичного рака толстой кишки с порядком антител следующим образом: CD8 (желтый), CD3 (зеленый), CD163 (оранжевый), панцитокератин (белый), PD-L1 (пурпур), FOXP3 (красный), рабочий DAPI (синий). (F) Мультиплекс асссис первичного рака толстой кишки с порядком антител следующим образом: CD8 (желтый), CD3 (зеленый), CD163 (оранжевый), панцитокератин (белый), PD-L1 (пурпур), FOXP3 (красный), нерабочий DAPI (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Разработка мультиплекса.
(A) Мультиплекс слайд рака толстой кишки в 7-цветной мультиплекс. (B) Пустой слайд в 7-цветной мультиплекс с использованием ткани рака толстой кишки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Анализ специфики 7-цветного мультиплекса.
(A) Мультиплекс композитное изображение с антителами следующим образом: CD8 (желтый), CD3 (зеленый), CD163 (оранжевый), pancytokeratin (белый), Ki67 (красный), DAPI (синий). (B) Патология яркое поле зрения изображения в панели На CD3 только вид. (C) Патология яркое поле зрения изображения в панели на CD163 только вид. (D) Мультиплекс композитное изображение с антителами следующим образом: CD8 (желтый), CD3 (зеленый), CD163 (оранжевый), панцитокератин (белый), PD-L1 (пурпур), FOXP3 (красный), DAPI (синий). (E) Патология яркое поле зрения изображения в панели D на CD3 только вид. (F) Патология яркое поле зрения изображения в панели D на CD163 только вид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нетронутые образцы тканей из твердой биопсии опухоли и хирургической резекции остаются важными диагностическими и прогностическими инструментами для анализа заболеваний, а также прогнозом пациента. Мультиплекс флуоресцентная иммуногистохимия (mfIHC) является новым методом, который сочетает в себе преимущества иммуногистохимии (IHC), иммунофлуоресценции (ИФ) и цитометрии потока. Предыдущие методы зондирования клеток на месте позволили для оценки клеток к клетке договоренностей в среде ткани8, однако, низкое количество эпитопов, которые могут быть исследованы пределы комплексного анализа. Цитометрия потока, хотя и полезна при анализе многих типов клеток в образце, теряет пространственный контекст в силу подготовки образцов в виде одноклеточной подвески9,10. mfIHC мосты эти методы, сохраняя пространственный контекст клеточной микросреды и увеличение числа эпитопов, которые могут быть помечены при усилении сигнала на помечены эпитоп11. Предыдущие исследования использовали mfIHC для фенотипирования клеточной инфильтра цифрезы в раке и нераковых образцов тканей1,2,3,4,5,15. Пост-образный анализ также был использован для анализа пространственных взаимосвязейклеток и структур в микросреде тканей 1,2,4. Для надежного анализа сначала необходимо произвести конкретное и точное изображение. Техника ручного окрашивания, в отличие от автоматизированной системы окрашивания, позволяет лабораториям меньшего размера и с точки входить в стоимость доступа к этой технологии. Время оптимизации и время окрашивания являются одними из самых больших препятствий для получения надежного изображения для дальнейшего пространственного анализа.
Несколько общих правил повышают вероятность успешного генерации надежного композитного мультиплексного изображения и экономят время и ресурсы. Антитела, которые будут использоваться в мультиплексе, должны быть выбраны на основе успеха с ручным обычным IHC. Антиген поисковые буферы с рН 6 и рН 9 должны быть использованы для IHC для того, чтобы исследовать соответствующие антигена поиска для использования в мультиплексе. Развитие Monoplex необходимо для определения размещения антител в протоколе мультиплексирования. Обоснование этого является сложным и варьируется между образцами тканей и эпитопами. В некоторых случаях эпитоп может деградировать с несколькими шагами микроволновой печи и визуализация маркера теряется, как это часто бывает с CD3. FOXP3, однако, становится ярче с более микроволновой печи шаги и едва заметны, если поместить в первом или втором раунде мультиплекс13,14.
Процесс окрашивания начинается с вырезания ткани FFPE на заряженных слайдах. Первая проблема, которая может возникнуть, это падение тканей с горки после микроволновой печи. Когда заряженные слайды не используются, присоединение ткани к поверхности стекла ограничено, и ткань будет иметь либо чрезмерное складывание, либо может полностью соскользнуть. Для дальнейшего обеспечения ткани придерживается слайдов во время процесса окрашивания, несколько методов выполняются. Во-первых, резки блоков на слайды, чистейшая форма воды работает лучше всего. Для некоторых лабораторий деионизированной воды может быть достаточно, но дистиллированная вода работает лучше всего. Горки должны быть высушены плоскими сразу после резки на 37 градусов по Цельсию в одночасье. Для дальнейшего обеспечения соблюдения, слайды затем помещаются в печь гибридизации и запеченные лежа на 60 градусов по Цельсию в течение одного часа непосредственно перед использованием. Хотя фиксация формалина уже произошла в процессе первоначальной подготовки ткани, размещение слайдов в нейтральном буферизированном формилине в течение 30 минут после процесса депарафинизации и регидратации повышает структурную целостность установленного ткань1,13.
Ручной процесс окрашивания может занять до трех, 8-часовых дней в зависимости от количества используемых антител. Как избежать ловушек имеет важное значение в экономии времени и щадящих реагентов. Первая распространенная ошибка часто возникает при подготовке реагента. Вода отличается между лабораториями и может быть единственным отличием в результатах от одной лаборатории к другой. Использование того же, а также чистый источник воды для всех реакций и реагентов обеспечивает последовательный результат. Антитела, блокирующий раствор и флюорофоры лучше всего работают при комнатной температуре. Чтобы избежать ловушек в реагенте и подготовке рабочего раствора, используйте одну и ту же воду для всех реагентов. Также используйте все рабочие растворы и реагенты при комнатной температуре.
Устранение проблем mfIHC имеет важное значение и соблюдение строгих лабораторных руководящих принципов, имеющих решающее значение для ограничения загрязнения компонентов и/или ошибки оператора. Производство неоптимальных изображений приведет к перекосу результатов и приведет к ложноположительным и отрицательным популяциям клеток, что может негативно повлиять на данные. Поскольку окончательный анализ обычно включает в себя компьютерные фенотипы, основанные на машинном обучении, небольшие ошибки в окрашивании могут быть увеличены, чтобы повлиять на весь набор данных. Например, хотя все пятна могут работать отлично, ошибка или упущение DAPI предотвратит будущую сегментацию клеток и подсчет, что сделает эксперимент бесполезным. Анализ программного обеспечения использует DAPI окрашивания не только для идентификации клеток, но назначает х и у координаты для каждой клетки, и если мультиплекс имеет тусклый, плохо ограничен, или диффузного DAPI окрашивания, изображение не может быть использовано и мультиплекс должен быть переиздан или попытка спасения и повторного окрашивания DAPI. Использование программных компонентов, таких как патология и яркие поля мнения укрепит уверенность в чувствительности и специфичности в начале процесса оптимизации и предотвратить ошибки в начале процесса мультиплекса.
Изменение аспектов процесса визуализации также может помочь в оптимизации изображения. Например, использование изображения с помощью DAPI в качестве визуального пособия помогает избежать размытых изображений. Добавление недавно созданной библиотеки флюорофоров в программное обеспечение обеспечит чистое изображение и менее спектральное перекрытие каждого флюорофора на этапе анализа и использование пустого слайда для извлечения автофлюоресценции усиливает маркеры и усиливает изображение Качество.
Использование образцов тканей имеет и будет оставаться в качестве важного инструмента в исследовании патофизиологии болезни. Новые технологии расширили наше понимание взаимодействия между клетками и mfIHC является перспективным новым игроком. Оптимизация и точность в процессе окрашивания в этом методе имеет первостепенное значение для правильного использования и дальнейшего анализа взаимодействия между клетками и клетками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Эда Стака, ранее от Перкина Элмера, за помощь в настройке и оптимизации оригинального мультиплексного окрашивания. Авторы также хотели бы поблагодарить Кристен Шмидт из Akoya Biosciences за советы с использованием программного обеспечения для анализа. Исследование, о которых сообщается в этой публикации, было поддержано Национальными институтами здравоохранения по борьбе с раком под номером премии P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA224144501 (mpm, hc), CA170568 (hc). Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения. Дополнительную поддержку оказали Джеффри Колби Колби Колона рака и Том А. Лю Мемориал научно-исследовательских фондов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
- Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
- Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Phenoptics Research Solutions. Perkin Elmer Manual. , 32 (2016).
- Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , Perkin Elmer Manual. (2014).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
