Optimalisatie, ontwerp en Vermijd valkuilen in handmatige multiplex fluorescerende immunohistochemie
Summary
Multiplex fluorescerende immunohistochemie is een opkomende technologie die het mogelijk maakt de visualisatie van meerdere celtypen binnen intact formalin-vaste, paraffine ingesloten (FFPE) weefsel. Gepresenteerd zijn richtlijnen voor het waarborgen van een succesvol 7-kleuren multiplex met instructies voor het optimaliseren van antilichamen en reagentia, het voorbereiden van dia’s, ontwerp en tips voor het vermijden van veelvoorkomende problemen.
Abstract
Micro-milieuevaluatie van intact weefsel voor analyse van celinfiltratie en ruimtelijke ordening zijn essentieel in het begrijpen van de complexiteit van ziekteprocessen. De in het verleden gebruikte principe technieken omvatten immunohistochemie (IHC) en immunofluorescentie (IF) die visualisatie van cellen mogelijk maken als een momentopname in de tijd met behulp van tussen 1 en 4 markeringen. Beide technieken hebben tekortkomingen, met inbegrip van moeilijkheid kleuring slecht antigene doelen en beperkingen met betrekking tot kruis soorten reactiviteit. IHC is betrouwbaar en reproduceerbaar, maar de aard van de chemie en het vertrouwen op het zichtbare lichtspectrum maakt het mogelijk slechts een paar markers te gebruiken en maakt co-lokalisatie uitdagend. Gebruik van als verbreedt potentiële markers maar meestal vertrouwt op bevroren weefsel als gevolg van de uitgebreide weefsel auto fluorescentie na formaline fixatie. Flow Cytometry, een techniek die gelijktijdige labeling van meerdere epitopes mogelijk maakt, abrogates veel van de tekortkomingen van IF en IHC, echter, de noodzaak om cellen te onderzoeken als een eencellige suspensie verliest de ruimtelijke context van cellen die belangrijke biologische Relaties. Multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfIHC) overbrugt deze technologieën waardoor multi-epitope cellulaire fenotyping in formaline vaste paraffine ingebed (FFPE) weefsel met behoud van de algehele micro-omgeving architectuur en ruimtelijke relatie van cellen binnen intact onverstoorde weefsel. Hoge fluorescentie intensiteit fluoroforen die covalent binding aan de weefsel epitoop maakt meerdere toepassingen van primaire antilichamen zonder zorgen van soort specifieke Kruisreactiviteit door secundaire antilichamen. Hoewel deze technologie heeft bewezen betrouwbare en nauwkeurige beelden voor de studie van de ziekte te produceren, het proces van het creëren van een nuttige mfIHC kleuring strategie kan tijdrovend en veeleisende als gevolg van uitgebreide optimalisatie en ontwerp. Om robuuste beelden te maken die nauwkeurige cellulaire interacties in situ vertegenwoordigen en om de optimalisatie periode voorhand matige analyse te verzachten, worden hier gepresenteerd zijn methoden voor de voorbereiding van dia’s, het optimaliseren van antilichamen, multiplex ontwerp en fouten vaak aangetroffen tijdens het kleuringsproces.
Introduction
Visualisatie van een intact tumor micro Environment (TME) is essentieel bij het evalueren van niet alleen cellulaire infiltratie in vaste maligniteiten, maar cel naar celinteracties ook. Multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfihc) is ontstaan als een effectief hulpmiddel voor multi-antigen fenotyping van cellen in de studie van kanker en geassocieerde ziekten1,2,3,4, 5,6,7. Dit, in combinatie met nieuwe software en Programma’s die zijn ontworpen om grote gegevenssets te analyseren, maakt observatie van complexe interacties tussen cellen1,2,4mogelijk. De snelheids beperkende factor bij het verzamelen van gegevens is vaak de kwaliteit van het gekleurd weefsel voorafgaand aan de analyse.
Eerdere technieken die worden gebruikt voor fenotype cellen in de TME omvatten immunohistochemie (IHC), immunofluorescentie (IF) en Flowcytometrie die allemaal significante beperkingen hebben. IHC maakt gebruik van formaline vaste paraffine ingesloten (FFPE) weefsel secties die zijn gedeparaffiniseerd en gerehydrateerd voordat ze worden gekleurd door meestal één antilichaam. Gebruik van een mierikswortelperoxidase (HRP) gebonden secundair antilichaam en een chemische reactie maakt visualisatie van een enkele antigene epitoop8. Hoewel IHC betrouwbaar is en wordt uitgevoerd op FFPE-weefsel dat gemakkelijk te werken is, betekent beperkingen voor het zichtbare lichtspectrum dat slechts één of twee markeringen betrouwbaar kunnen worden onderscheiden en colokalisatie van antigenen heel moeilijk8. Een manier om de beschikbare markers uit te breiden en daarom antigenen die op een enkele sectie kunnen worden geproteand, is om te veranderen in fluorescentie die het mogelijk maakt om een breder bereik van het visuele spectrum te gebruiken. Voor als, bevroren of FFPE weefsel wordt overgebracht op dia’s en antilichamen gebruikt die zijn geconjugeerd aan verschillende fluor Foren. Terwijl dit verhoogt het aantal antigenen die kunnen worden geprobed, er zijn verschillende belangrijke beperkingen. Ten eerste, omdat elk antilichaam meestal slechts één de heeft bevestigd, is de helderheid vaak niet sterk genoeg om weefsel autofluorescentie te overwinnen. Het is om deze reden, de meeste als wordt uitgevoerd op bevroren weefsel dat is duur om op te slaan en moeilijk om mee te werken. Een beperkt aantal fluorescerende Tags zijn beschikbaar voor gebruik als gevolg van spectrale overlapping en kruis soorten reactiviteit, vooral wanneer niet-geconjugeerde antilichamen worden gebruikt. Flow cytometrie, dat bestaat uit de verwerking van vers weefsel tot een enkele celsuspensie en labeling met fluorescerende antilichamen is de gouden standaard voor immunofenotypering voor decennia9,10. Een voordeel van flow cytometrie is de mogelijkheid om meerdere antilichamen zonder bezorgdheid te labelen voor soorten Kruisreactiviteit, omdat de meeste zijn geconjugeerd. Omdat de cellen worden “gevisualiseerd” door een machine en geen menselijke ogen, er zijn veel meer fluor Foren beschikbaar, maar dit komt met een kostprijs. De compensatie moet handmatig worden uitgevoerd, waardoor de resultaten van valse positieve en negatieve populaties aanzienlijk kunnen worden gewijzigd. De meest significante beperking van flow cytometrie is dat weefsel architectuur en vervolgens alle ruimtelijke informatie verloren gaat door de noodzaak voor de schorsing van de enkelvoudige cellen.
Multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfihc) met behulp van een geautomatiseerde fluorescerende Microscoop in combinatie met nieuwe software combineert de voordelen van IHC, if en flow flowcytometrieonderzoeken door het toestaan van multi-antigen weefsel kleuring met signaalversterking en behoud van ruimtelijke relaties zonder de noodzaak van compensatie. FFPE weefsel wordt geplaatst op geladen glijbanen die, na antigeen opvraging, een ronde van primaire antilichamen ondergaan op het doel antigeen van belang, gevolgd door een secundair antilichaam met een HRP chemisch plaatje, vergelijkbaar met IHC. Na de plaatsing van het secundaire antilichaam resulteert een HRP-specifieke reactie in een covalente binding van de aan de epitoop van belang11. Zodra het weefsel is gelabeld, een andere ronde van de verwarming van de dia’s is voltooid het verwijderen van de eerder toegepaste primaire en secundaire antilichaam complex verlaten alleen de fluorescerende tag gebonden aan de weefsel epitoop11. Dit maakt het mogelijk om meerdere antilichamen van elke soort opnieuw toe te passen zonder zorgen voor Kruisreactiviteit11,12. Om de behoefte aan handmatige compensatie van meerdere fluorescerende kleurstoffen te minimaliseren, wordt een verzameling van fluor Foren met weinig spectrale overlap met inbegrip van een nucleaire Counter vlek gebruikt om de mfIHC te voltooien. Om rekening te houden met de autofluorescentie die met ffpe-weefsel is aangetroffen, trekt de software de autofluorescentie van de uiteindelijke afbeelding af met behulp van een afbeelding van een blanco dia die mogelijk is vanwege de sterkte van antigeen specifieke fluorescentie na de signaalversterking. Met behulp van nieuwe Programma’s die zijn ontworpen voor grote gegevenssets, kunnen cellocaties worden geïdentificeerd en geanalyseerd voor ruimtelijke context1,2,4. De meest significante beperking van deze techniek is de optimalisatie tijd. Een gedetailleerde methodologie met instructies voor experimentele ontwerp-en kleurings-en beeldvormings strategie vindt u hier. mfIHC is nuttig voor laboratoria die momenteel geen geoptimaliseerd geautomatiseerd kleurings systeem hebben dat de ruimtelijke context van cel-naar-celinteracties in intact FFPE-weefsel met behulp van de handmatige techniek beter zou willen begrijpen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intact weefsel specimens van solide tumor biopsie en chirurgische resectie blijven belangrijke diagnostische en voorspellende instrumenten voor ziekte-analyse, evenals de prognose van de patiënt. Multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfIHC) is een nieuwe techniek die de voordelen van immunohistochemie (IHC), immunofluorescentie (IF) en Flowcytometrie combineert. Eerdere methoden voor sonde cellen in situ hebben toegestaan voor de evaluatie van cel-naar-cel regelingen in een weefsel omgeving8</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Ed stack, eerder van Perkin Elmer, bedanken voor zijn hulp bij het instellen en optimaliseren van de originele multiplex kleuring. De auteurs willen ook Kristen Schmidt van Akoya Biosciences bedanken voor tips met behulp van de analyse software. Het onderzoek dat in deze uitgave werd gerapporteerd, werd gesteund door de National Cancer Institutes of Health onder het Awardnummer P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (JS), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, HC), CA170568 (HC). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Extra ondersteuning werd geboden door Jeffery A. Colby Colon Cancer en Tom Liu Memorial Research funds.
Materials
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
- Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
- Katikireddy, K. R., O’Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Phenoptics Research Solutions. . Perkin Elmer Manual. , 32 (2016).
- . . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2014).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
