手動多重蛍光免疫組織化学における最適化、設計、および落とし穴の回避
Summary
多重蛍光免疫組織化学は、無傷のホルマリン固定、パラフィン埋め込み(FFPE)組織内の複数の細胞タイプの可視化を可能にする新しい技術です。抗体と試薬を最適化し、スライドを準備し、一般的な問題を回避するためのヒントを準備するための指示を持つ7色多重を成功させるためのガイドラインを提示します。
Abstract
細胞浸潤および空間組織の分析のための無傷の組織の微小環境評価は、疾患プロセスの複雑さを理解する上で不可欠である。過去に使用された原理技術には、免疫組織化学(IHC)と免疫蛍光(IF)が含まれており、1~4マーカーを用いて時間内に細胞をスナップショットとして可視化することができます。いずれの技術も、抗原性の低い標的を染色するのが難しい、種間反応性に関する制限を含む欠点を有する。IHCは信頼性が高く再現可能ですが、可視光スペクトルに対する化学の性質と依存性により、少数のマーカーしか使用できず、共ローカリゼーションが困難になります。IFの使用は潜在的なマーカーを広げるが、通常、ホルマリン固定後の広範な組織自己蛍光による凍結組織に依存する。フローサイトメトリーは、複数のエピトープの同時標識を可能にする技術であり、IFおよびIHCの欠陥の多くを損なうが、単一細胞懸濁液として細胞を調べる必要性は、重要な生物学的生物学的を廃棄する細胞の空間的文脈を失う関係。多重蛍光免疫組織化学(mfIHC)は、これらの技術を橋渡しし、全体的な微小環境アーキテクチャと空間を維持しながら、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織におけるマルチエピトープ細胞表現を可能にします。無傷の組織内の細胞の関係。組織エピトープに共有結合する高蛍光強度蛍光蛍光ホルは、二次抗体による種特異的交差反応性を心配することなく、一次抗体の複数の応用を可能にする。この技術は、疾患の研究のための信頼性と正確な画像を生成することが証明されていますが、有用なmfIHC染色戦略を作成するプロセスは、広範な最適化と設計のために時間がかかり、厳密なことができます。現場で正確な細胞相互作用を表す堅牢な画像を作成し、手動分析の最適化期間を緩和するために、スライド準備、抗体の最適化、多重設計、エラーを示します。染色プロセス中に一般的に遭遇します。
Introduction
無傷の腫瘍微小環境(TME)の可視化は、固体悪性腫瘍における細胞浸潤だけでなく、細胞間相互作用も評価する上で不可欠である。多重蛍光免疫組織化学(mfIHC)は、癌および関連疾患1、2、3、4、および癌の研究における細胞の多抗原表現型の有効なツールとして出現した。 5,6,7.これは、大きなデータセットを分析するように設計された新しいソフトウェアおよびプログラムと組み合わせることで、セル1、2、4間の複雑な相互作用の観察を可能にする。データ取得におけるレート制限係数は、多くの場合、分析前の染色組織の品質です。
TMEで細胞を表現するために使用される以前の技術には、免疫組織化学(IHC)、免疫蛍光(IF)およびフローサイトメトリーが含まれており、そのすべてが重要な制限を提示する。IHCは、最も頻繁に1つの抗体によって染色される前に、脱パラフィン化および水分補給されるホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織セクションを使用しています。ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体および化学反応の使用は、単一の抗原エピトープ8の可視化を可能にする。IHCは信頼性が高く、作業が容易なFFPE組織に対して行われるが、可視光スペクトルに対する制限は、1つまたは2つのマーカーのみが非常に困難な抗原の信頼できる区別およびコローカライズできることを意味する8。利用可能なマーカーを拡大し、したがって、単一のセクションでプローブすることができる抗原を拡大する方法は、視覚スペクトルのより広い範囲の使用を可能にする蛍光に変更することです。IFの場合、凍結またはFFPE組織は、様々な蛍石に結合されるスライドおよび抗体上に移される。これにより、プローブできる抗原の数が増加しますが、いくつかの重要な制限があります。第一に、各抗体は通常、蛍光素が1つしか付着していないため、明るさは組織の自己蛍光を克服するのに十分な強さではないことが多い。このため、ほとんどのIFは貯蔵が高価で作業が困難な凍結組織に対して行われる。特に非共役抗体を使用する場合は、スペクトルの重なりと異種反応性のために使用できる蛍光タグの限られた数が利用可能です。フローサイトメトリーは、新鮮な組織処理を単一細胞懸濁液に処理し、蛍光抗体による標識を行い、数十年にわたり免疫フェノタイピングのゴールドスタンダードとなっています9,10。フローサイトメトリーの利点は、ほとんどの場合が結合されているように、種の交差反応性を気にせずに複数の抗体にラベルを付ける能力です。細胞は人間の目ではなく機械によって「視覚化」されるので、利用可能な蛍煙がはるかに多くありますが、これはコストがかかります。報酬は手動で行う必要があり、誤った正と負の母集団を生み出す結果を大幅に変更する可能性があります。フローサイトメトリーの最も重要な制限は、組織アーキテクチャと、その後、すべての空間情報が単一細胞懸濁液の必要性によって失われるということです。
自動蛍光顕微鏡を用いた多重蛍光免疫組織化学(mfIHC)は、IHC、IF、フローサイトメトリーの利点を組み合わせ、シグナル増幅による多抗原組織染色を可能にし、補償を必要とせずに空間的な関係を保持します。FFPE組織は、抗原検索後、目的の標的抗原に一次抗体適用のラウンドを受け、続いてIHCと同様のHRP化学タグを有する二次抗体を受ける荷電スライド上に置かれる。二次抗体の配置後、HRP特異的反応は、蛍色素が目的のエピトープ11に共有結合する結果をもたらす。組織が標識されると、スライドを加熱する別のラウンドが完了し、組織エピトープ11に結合した蛍光タグのみを残して、以前に適用された一次および二次抗体複合体を除去する。これにより、任意の種の複数の抗体を、交差反応性11、12を気にすることなく再適用することができる。複数の蛍光色素の手動補償の必要性を最小限に抑えるために、核カウンター染色を含むスペクトルの重みがほとんどない蛍光色素のコレクションを使用してmfIHCを完成させる。FFPE組織で遭遇した自己蛍光を考慮して、ソフトウェアは、蛍光色素に続く抗原特異的蛍光の強さのために可能である空白のスライドからの画像を使用して、最終的な画像から自己蛍光を減算します。信号増幅。大規模なデータセット用に設計された新しいプログラムを使用して、セルの位置を識別し、空間コンテキスト 1、2、4を分析できます。この手法の最も重要な制限は、最適化時間です。実験設計と染色およびイメージング戦略の手順を含む詳細な方法論がここに見つかります。mfIHCは、手動技術を使用して、無傷のFFPE組織における細胞間相互作用の空間的コンテキストをよりよく理解したい、最適化された自動染色システムを現在持っていない実験室に役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
固形腫瘍生検および外科的切除からの無傷の組織標本は、疾患分析および患者の予後のための重要な診断および予測ツールのままである。多重蛍光免疫組織化学(mfIHC)は、免疫組織化学(IHC)、免疫蛍光(IF)およびフローサイトメトリーの利点を組み合わせた新しい技術です。その場で細胞をプローブする以前の方法は、組織環境8における細胞間配置の評価を可能にしたが、し?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、以前パーキン・エルマーから来たエド・スタックに、オリジナルの多重染色のセットアップと最適化に関する彼の支援に感謝したいと思います。著者らはまた、分析ソフトウェアを使用してヒントをアコヤバイオサイエンスからクリステンシュミットに感謝したいと思います。この出版物で報告された研究は、賞番号P30CA046592の下で国立がん研究所によってサポートされました, K08CA201581(1lf)、K08CA234222(js)、R01CA15158807(mpm)、RSG1417301CSM(mpm)、R01CA19807403(mpm)、U01CA22414501(午後)、hcCA170568 (hc)。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。ジェフリー・A・コルビー・コロン癌とトム・リウ記念研究基金による追加支援が行われました。
Materials
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
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