Ottimizzazione, progettazione ed evitare le falle nella immunostiera fluorescente manuale
Summary
L’immunohistochimica fluorescente multiplex è una tecnologia emergente che consente la visualizzazione di più tipi di cellule all’interno del tessuto incorporato in parina (FFPE) intatto. Le linee guida presentate sono linee guida per garantire un multiplex a 7 colori di successo con istruzioni per ottimizzare anticorpi e reagenti, preparare diapositive, progettare e suggerimenti per evitare problemi comuni.
Abstract
La valutazione microambiente del tessuto intatto per l’analisi dell’infiltrazione cellulare e dell’organizzazione spaziale è essenziale per comprendere la complessità dei processi della malattia. Le tecniche principali utilizzate in passato includono l’immunosintochimica (IHC) e l’immunofluorescenza (IF) che consentono la visualizzazione delle cellule come un’istantanea nel tempo utilizzando tra 1 e 4 marcatori. Entrambe le tecniche presentano carenze, tra cui difficoltà a macchiare obiettivi scarsamente antigenici e limitazioni legate alla reattività tra specie. IHC è affidabile e riproducibile, ma la natura della chimica e della dipendenza dallo spettro della luce visibile consente di utilizzare solo pochi marcatori e rende difficile la co-localizzazione. L’uso di IF amplia i potenziali marcatori, ma in genere si basa sul tessuto congelato a causa dell’estesa autofluorescenza dei tessuti dopo la fissazione della formalina. Citometria di flusso, una tecnica che consente l’etichettatura simultanea di più epitopi, abroga molte delle carenze di SE e IHC, tuttavia, la necessità di esaminare le cellule come una singola sospensione cellulare perde il contesto spaziale delle cellule che scartano importanti sostanze biologiche Relazioni. L’immunohistochimica fluorescente multiplex (mfIHC) collega queste tecnologie consentendo la fenotipizzazione cellulare multi-epitopo nel tessuto incorporato a paraffina fissa di formalina (FFPE), preservando l’architettura complessiva del microambiente e lo spazio relazione delle cellule all’interno di tessuto intatto senza interruzioni. L’alta intensità fluorescente fluorofori che si legano covalentmente all’epitopo tissutale consente l’applicazione multipla di anticorpi primari senza preoccuparsi della reattività incrociata specifica delle specie da parte di anticorpi secondari. Anche se questa tecnologia ha dimostrato di produrre immagini affidabili e accurate per lo studio della malattia, il processo di creazione di un’utile strategia di colorazione mfIHC può richiedere molto tempo e richiede molto tempo e richiede grazie a un’ampia ottimizzazione e progettazione. Al fine di creare immagini robuste che rappresentano interazioni cellulari accurate in loco e per mitigare il periodo di ottimizzazione per l’analisi manuale, presentate qui sono metodi per la preparazione delle diapositive, l’ottimizzazione degli anticorpi, la progettazione del multiplex e gli errori comunemente riscontrato durante il processo di colorazione.
Introduction
La visualizzazione di un microambiente tumorale intatto (TME) è essenziale nella valutazione non solo dell’infiltrazione cellulare nelle neoplasie solide, ma anche delle interazioni tra cellule e cellule. L’immunoistochimica fluorescente multiplex (mfIHC) è emersa come uno strumento efficace per la fenofitipo multi-antigene delle cellule nello studio del cancro e delle malattie associate1,2,3,4, 5,6,7. Questo, in combinazione con nuovi software e programmi progettati per analizzare grandi set di dati, consente l’osservazione di interazioni complesse tra le celle1,2,4. Il fattore di limitazione del tasso nell’acquisizione dei dati è spesso la qualità del tessuto macchiato prima dell’analisi.
Le tecniche precedenti utilizzate per le cellule fenotipiche nel TME includono l’immunosintochimica (IHC), l’immunofluorescenza (IF) e la citometria di flusso che presentano limitazioni significative. IHC utilizza le sezioni di tessuto di paraffina fissa (FFPE) formalina che vengono deparaffinate e reidratate prima di essere macchiate dal più delle volte un anticorpo. L’uso di un anticorpo secondario legato alla perossidasi di rafano (HRP) e una reazione chimica consente la visualizzazione di un singolo epitopo antigenico8. Mentre IHC è affidabile ed eseguito su tessuto FFPE che è facile da lavorare, limitazioni allo spettro di luce visibile significa che solo uno o due marcatori possono essere affidabili distinti e co-localizzazione di antigeni abbastanza difficile8. Un modo per espandere i marcatori disponibili e quindi gli antigeni che possono essere sondati su una singola sezione è quello di passare alla fluorescenza che consente l’uso di una gamma più ampia dello spettro visivo. Per IF, il tessuto congelato o FFPE viene trasferito su vetrini e anticorpi utilizzati che sono coniugati a vari fluorofori. Mentre questo aumenta il numero di antigeni che possono essere sondati, ci sono diverse limitazioni importanti. In primo luogo, poiché ogni anticorpo in genere ha solo un fluoroforo attaccato, la luminosità spesso non è abbastanza forte per superare l’autofluorescenza dei tessuti. È per questo motivo, la maggior parte IF viene eseguita su tessuto congelato che è costoso da memorizzare e difficile da lavorare. Un numero limitato di tag fluorescenti sono disponibili per l’uso a causa della sovrapposizione spettrale e della reattività delle specie incrociate, in particolare quando vengono utilizzati anticorpi non coniugati. La citometria di flusso, che consiste nell’elaborazione di tessuti freschi in una singola sospensione cellulare enell’etichettatura con anticorpi fluorescenti è stato il gold standard per l’immunofenofizzazione per decenni 9,10. Un vantaggio della citometria di flusso è la capacità di etichettare più anticorpi senza preoccuparsi della reattività incrociata delle specie, poiché la maggior parte è coniugata. Poiché le cellule sono “visualizzate” da una macchina e non da occhi umani, ci sono molti più fluorofori disponibili, ma questo ha un costo. La compensazione deve essere fatta manualmente che può alterare significativamente i risultati producendo popolazioni false positive e negative. La limitazione più significativa della citometria di flusso è che l’architettura dei tessuti e successivamente tutte le informazioni spaziali vengono perse dalla necessità di sospensione di singole cellule.
Multiplex fluorescente immunohistochimica (mfIHC) utilizzando un microscopio fluorescente automatizzato in combinazione con un nuovo software combina i benefici di IHC, SE e citometria di flusso, consentendo la colorazione dei tessuti multi-antigene con l’amplificazione del segnale e mantenimento delle relazioni spaziali senza la necessità di una compensazione. Il tessuto FFPE viene posto su vetrini carichi che, dopo il recupero dell’antigene, subiscono un ciclo di applicazione primaria dell’anticorpo all’antigene bersaglio di interesse seguito da un anticorpo secondario con un tag chimico HRP, simile all’IHC. Dopo il posizionamento dell’anticorpo secondario, una reazione specifica HRP si traduce in un fluoroforo che si lega covalentmente all’epipologo di interesse11. Una volta etichettato il tessuto, un altro ciclo di riscaldamento dei vetrini viene completato rimuovendo il complesso anticorpale primario e secondario precedentemente applicato lasciando solo il tag fluorescente legato all’epitopo del tessuto11. Ciò consente di riapplicare più anticorpi di qualsiasi specie senza preoccuparsi della reattività incrociata11,12. Per ridurre al minimo la necessità di una compensazione manuale di più coloranti fluorescenti, una raccolta di fluorofori con poca sovrapposizione spettrale, inclusa una macchia nucleare, viene utilizzata per completare il mfIHC. Per tenere conto dell’autofluorescenza incontrata con il tessuto FFPE, il software sottrae l’autofluorescenza dall’immagine finale utilizzando un’immagine da una diapositiva vuota che è possibile a causa della forza della fluorescenza specifica dell’antigene dopo fluoroforo l’amplificazione del segnale. Utilizzando nuovi programmi progettati per grandi set di dati, le posizioni delle celle possono essere identificate e analizzate per il contesto spaziale1,2,4. La limitazione più significativa di questa tecnica è il tempo di ottimizzazione. Una metodologia dettagliata con istruzioni per la progettazione sperimentale e la strategia di colorazione e imaging si trova qui. mfIHC sarà utile per i laboratori che attualmente non dispongono di un sistema di colorazione automatizzato ottimizzato che vorrebbe comprendere meglio il contesto spaziale delle interazioni cellula-cellula nel tessuto FFPE intatto utilizzando la tecnica manuale.
Protocol
Representative Results
Discussion
I campioni di tessuto intatti della biopsia tumorale solida e della resezione chirurgica rimangono importanti strumenti diagnostici e predittivi per l’analisi della malattia e la prognosi del paziente. L’immunohistochimica fluorescente multiplex (mfIHC) è una nuova tecnica che combina i benefici dell’immunostochimica (IHC), l’immunofluorescenza (IF) e la citometria di flusso. Precedenti metodi per sondare le cellule in situ hanno permesso la valutazione delle disposizioni da cellula a cellula in un ambiente tissutale<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Ed Stack, precedentemente di Perkin Elmer, per la sua assistenza con l’impostazione e l’ottimizzazione della colorazione multiplex originale. Gli autori desiderano anche ringraziare Kristen Schmidt di Akoya Biosciences per suggerimenti sull’utilizzo del software di analisi. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Cancer Institutes of Health sotto il premio numero P30CA046592, K08CA201581(tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health. Un ulteriore sostegno è stato fornito da Jeffery A. Colby Colon Cancer e Tom Liu Memorial Research Funds.
Materials
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
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