Multiplex fluorescerende immunhistokjemi er en ny teknologi som muliggjør visualisering av flere celletyper innenfor intakt formalin, parafin embedded (FFPE) vev. Presentert er retningslinjer for å sikre en vellykket 7-farge multiplex med instruksjoner for å optimalisere antistoffer og reagenser, forberede lysbilder, design og tips for å unngå vanlige problemer.
Mikromiljøet evaluering av intakt vev for analyse av celle infiltrasjon og romlig organisasjon er avgjørende for å forstå kompleksiteten i sykdommen prosesser. Prinsippet teknikker som brukes i fortiden inkluderer immunhistokjemi (IHC) og immunofluorescence (IF) som muliggjør visualisering av celler som et øyeblikksbilde i tid ved hjelp av mellom 1 og 4 markører. Begge teknikkene har svakheter inkludert problemer farging dårlig antigen mål og begrensninger knyttet til kryss-arter reaktivitet. IHC er pålitelig og reproduserbar, men arten av kjemi og avhengighet av det synlige lyset spekteret gir bare noen få markører som skal brukes og gjør co-lokalisering utfordrende. Bruk av IF utvider potensielle markører, men vanligvis er avhengig av frosset vev på grunn av den omfattende vev autofluorescence etter formalin fiksering. Flow flowcytometri, en teknikk som muliggjør samtidig merking av flere epitopes, opphever mange av manglene ved IF og IHC, men behovet for å undersøke celler som en enkelt celle suspensjon mister romlige konteksten av celler forkaste viktige biologiske Relasjoner. Multiplex fluorescerende immunhistokjemi (mfIHC) broer disse teknologiene muliggjør multi-epitope mobilnettet bestemmelse av fenotype i formalin fast parafin embedded (FFPE) vev samtidig bevare den samlede mikromiljøet arkitektur og romlig forholdet mellom celler i intakt uforstyrret vev. Høy fluorescerende intensitet fluorophores som covalently bånd til vevet epitope muliggjør flere anvendelser av primære antistoffer uten bekymring for arter spesifikke kryss-reaktivitet av sekundære antistoffer. Selv om denne teknologien har vist seg å produsere pålitelige og nøyaktige bilder for studiet av sykdom, kan prosessen med å lage en nyttig mfIHC farging strategi være tidkrevende og krevende på grunn av omfattende optimalisering og design. For å gjøre robuste bilder som representerer nøyaktige mobilnettet interaksjoner in-situ og å redusere optimaliserings perioden for manuell analyse, som presenteres her er metoder for lysbilde forberedelse, optimalisere antistoffer, multiplex design samt feil ofte oppstår under fargeprosessen.
Visualisering av en intakt tumor mikromiljøet (TME) er viktig i å evaluere ikke bare cellulære infiltrasjon i solid ondartet men celle til celle interaksjoner også. Multiplex fluorescerende immunhistokjemi (mfIHC) har dukket opp som et effektivt verktøy for multi-antigen bestemmelse av fenotype av celler i studiet av kreft og tilhørende sykdommer1,2,3,4, 5,6,7. Dette, i kombinasjon med romanen programvare og programmer som er utviklet for å analysere store datasett, muliggjør observasjon av komplekse interaksjoner mellom cellene1,2,4. Satsen begrensende faktor i datainnhenting er ofte kvaliteten på farget vev før analyse.
Tidligere teknikker som brukes til å fenotype celler i TME inkluderer immunhistokjemi (IHC), immunofluorescence (IF) og Flow flowcytometri som alle utgjør betydelige begrensninger. IHC bruker formalin faste parafin embedded (FFPE) vev seksjoner som er deparaffinized og rehydrert før de blir farget av oftest ett antistoff. Bruk av et pepperrot peroksidase (HRP) bundet sekundært antistoff og en kjemisk reaksjon tillater visualisering av en enkelt antigen epitope8. Mens IHC er pålitelig og utført på FFPE vev som er lett å arbeide med, begrensninger til det synlige lyset spekteret betyr bare en eller to markører kan være pålitelig skilles og colocalization av antigener ganske vanskelig8. En måte å utvide tilgjengelige markører og derfor antigener som kan være analysert på en enkelt seksjon er å bytte til fluorescens som tillater bruk av et bredere spekter av det visuelle spekteret. For IF, frosset eller FFPE vev overføres til lysbilder og antistoffer som brukes som er bøyd til ulike fluorophores. Selv om dette øker antall antigener som kan være analysert, er det flere viktige begrensninger. Først fordi hvert antistoff vanligvis bare har en fluoroforen vedlagt, lysstyrken er ofte ikke sterk nok til å overvinne vev autofluorescence. Det er av denne grunn, de fleste IF er utført på frossen vev som er dyrt å lagre og vanskelig å arbeide med. Et begrenset antall fluorescerende etiketter er tilgjengelig for bruk på grunn av Spectral overlapping og kryss arter reaktivitet spesielt når ikke-bøyd antistoffer brukes. Flow flowcytometri, som består av fersk vevs behandling i en enkelt celle suspensjon og merking med fluorescerende antistoffer har vært gullstandarden for immunfenotyping i flere ti år9,10. En fordel med strømnings flowcytometri er evnen til å merke flere antistoffer uten bekymring for at arter krysser reaktivitet, ettersom de fleste blir bøyd. Fordi cellene er “visualisere” av en maskin og ikke menneskelige øyne, det er langt mer fluorophores tilgjengelig, men dette kommer med en kostnad. Kompensasjon må gjøres manuelt som kan betydelig endre resultater produsere falske positive og negative populasjoner. Den mest vesentlige begrensningen av Flow flowcytometri er at vev arkitektur og deretter all romlig informasjon er tapt ved nødvendigheten av enkeltceller suspensjon.
Multiplex fluorescerende immunhistokjemi (mfIHC) ved hjelp av et automatisert fluorescerende mikroskop i kombinasjon med ny programvare kombinerer fordelene med IHC, IF og Flow flowcytometri ved at multi-antigen vev farging med signal forsterkning og oppbevaring av romlige forhold uten behov for kompensasjon. FFPE vev plasseres på ladet lysbilder som etter antigen henting, gjennomgår en runde av primær antistoff søknad til målet antigen av interesse etterfulgt av et sekundært antistoff med en HRP kjemisk kode, lik IHC. Etter plassering av sekundær antistoff, en HRP spesifikk reaksjon resulterer i en fluoroforen covalently binding til epitope av interesse11. Når vevet er merket, en ny runde av oppvarming lysbildene er fullført fjerne tidligere anvendt primære og sekundære antistoff kompleks slik at bare den fluorescerende koden bundet til vevet epitope11. Dette gjør det mulig for flere antistoffer av alle arter som kan brukes på nytt uten bekymring for kryss-reaktivitet11,12. For å minimere behovet for manuell kompensasjon av flere fluorescerende fargestoffer, brukes en samling av fluorophores med liten Spectral overlapping inkludert en kjernefysisk Counter flekken til å fullføre mfIHC. Å gjøre rede for det autofluorescence støtt på med FFPE tissue, programvare trekker det autofluorescence fra det final image benytter en image fra en fjerne skyve hvilke er mulig med hensyn til styrken av antigen spesifikk fluorescens fulgte fluoroforen signal forsterkning. Ved hjelp av romanen programmer laget for store datasett, celle steder kan identifiseres og analyseres for romlig kontekst1,2,4. Den mest vesentlige begrensningen av denne teknikken er optimaliserings tid. Her finner du en detaljert metodikk med instruksjoner for eksperimentell design og farge-og bildebehandlings strategi. mfIHC vil være nyttig for laboratorier som ikke har en optimalisert automatisert farging system som ønsker å bedre forstå romlig sammenheng med celle-til-celle interaksjoner i intakt FFPE vev ved hjelp av manuell teknikk.
Intakt vevsprøver fra solid tumor biopsi og kirurgiske reseksjon er fortsatt viktig diagnostiske og prediktiv verktøy for sykdoms analyse, samt pasient prognose. Multiplex fluorescerende immunhistokjemi (mfIHC) er en ny teknikk som kombinerer fordelene ved immunhistokjemi (IHC), immunofluorescence (IF) og Flow flowcytometri. Tidligere metoder for å granske celler in situ har tillatt for evaluering av celle-til-celle-ordninger i et vev miljø8, men det lave antallet epitopes som kan være analys…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Ed Stack, tidligere fra Perkin Elmer, for hans hjelp med oppsett og optimalisering av originale multiplex farging. Forfatterne vil også gjerne takke kristen Schmidt fra Akoya biovitenskap for tips ved hjelp av analyseprogramvare. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institutes of Health under Award nummer P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (MPM), RSG1417301CSM (MPM), R01CA19807403 (MPM), U01CA22414501 (MPM, HC), CA170568 (HC). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Ytterligere støtte ble levert av Jeffery A. Colby Colon Cancer og tom Liu Memorial Research Funds.
100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
Hybridization oven | FisherBiotech | ||
Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
Xylene | Fisher | X3P1GAL |