Optimering, design og undgåelse af faldgruber i manuel multiplex fluorescerende immun histokemi

Summary

Multiplex fluorescerende Immunhistokemi er en ny teknologi, der muliggør visualisering af flere celletyper inden for intakt formalin-fast, paraffinindlejret (FFPE) væv. Præsenteret er retningslinjer for at sikre en vellykket 7-farve multiplex med instruktioner til optimering af antistoffer og reagenser, forberede dias, design og tips til at undgå almindeligt problemer.

Abstract

Mikromiljø evaluering af intakt væv til analyse af celleinfiltration og rumlig organisation er afgørende for at forstå kompleksiteten af sygdomsprocesser. De tidligere anvendte teknikker omfatter immun histokemi (IHC) og immunofluorescens (IF), som muliggør visualisering af celler som et øjebliksbillede i tid ved hjælp af mellem 1 og 4 markører. Begge teknikker har mangler, herunder problemer med farvning af dårligt antigene mål og begrænsninger i forbindelse med reaktivitet på tværs af arter. IHC er pålidelig og reproducerbar, men karakteren af kemi og afhængighed af det synlige lys spektrum giver mulighed for kun et par markører, der skal anvendes, og gør Co-lokalisering udfordrende. Brug af IF udvider potentielle markører, men er typisk afhængig af frosset væv på grund af den omfattende vævs autofluorescens efter formalin fiksering. Flow cytometry, en teknik, der muliggør samtidig mærkning af flere epitoper, ophæver mange af manglerne ved hvis og IHC, men behovet for at undersøge celler som en enkelt cellesuspension mister den rumlige sammenhæng af celler kassere vigtige biologiske Relationer. Multiplex fluorescerende Immunhistokemi (mfihc) broer disse teknologier giver mulighed for multi-epitope cellulære fænotypebestemmelse i formalin fast paraffinindlejret (FFPE) væv samtidig bevare den samlede mikromiljø arkitektur og rumlige forholdet mellem cellerne i intakt uforbrudt væv. Fluorophores med høj fluorescerende intensitet, der kovalent er bundet til vævs epitop, muliggør flere anvendelser af primære antistoffer uden at bekymre sig om artsspecifik kryds reaktivitet med sekundære antistoffer. Selv om denne teknologi har vist sig at producere pålidelige og præcise billeder til studiet af sygdom, processen med at skabe en nyttig mfIHC farvning strategi kan være tidskrævende og krævende på grund af omfattende optimering og design. For at gøre robuste billeder, der repræsenterer nøjagtige cellulære interaktioner in-situ og for at afbøde optimering periode for manuel analyse, præsenteret her er metoder til slide forberedelse, optimering af antistoffer, multiplex design samt fejl almindeligt forekommende under farvningsprocessen.

Introduction

Visualisering af en intakt tumor mikromiljø (TME) er afgørende for at evaluere ikke kun cellulære infiltration i solide maligniteter, men celle til celle interaktioner samt. Multiplex fluorescerende immun histokemi (mfihc) er dukket op som et effektivt værktøj til multi-antigen-fænotypning af celler i studiet af kræft og tilknyttede sygdomme^{1,2,3,4, 5,6,7}. Dette, i kombination med nye software og programmer designet til at analysere store datasæt, muliggør observation af komplekse interaktioner mellem cellerne^1,2,4. Den sats begrænsende faktor i dataopsamling er ofte kvaliteten af det farvede væv før analyse.

Tidligere anvendte teknikker til fænotype celler i TME omfatter Immunhistokemi (IHC), immunofluorescens (IF) og flow cytometri, som alle har betydelige begrænsninger. IHC bruger formalin fast paraffinindlejret (FFPE) vævs sektioner, som er afparaffinerede og rehydreret, før de bliver plettet af oftest et antistof. Anvendelse af et peberrod-peroxidase (HRP)-bundet sekundært antistof og en kemisk reaktion giver mulighed for visualisering af en enkelt antigen epitop⁸. Mens IHC er pålidelig og udføres på FFPE væv, som er let at arbejde med, begrænsninger for det synlige lys spektrum betyder kun en eller to markører kan være pålidelig skelnes og samlokalisering af antigener ganske vanskeligt⁸. En måde at udvide tilgængelige markører og derfor antigener, der kan probed på en enkelt sektion er at skifte til fluorescens, som giver mulighed for brug af en bredere vifte af det visuelle spektrum. For hvis, frosne eller FFPE væv overføres på slides og antistoffer anvendes, der er konjugeret til forskellige fluorophorer. Mens dette øger antallet af antigener, der kan probed, der er flere vigtige begrænsninger. For det første fordi hvert antistof typisk kun har én fluoroforet vedhæftet, er lysstyrken ofte ikke stærk nok til at overvinde vævs autofluorescens. Det er af denne grund, de fleste hvis der udføres på frosset væv, som er dyrt at opbevare og svært at arbejde med. Et begrænset antal fluorescerende Tags er tilgængelige til brug på grund af spektral overlap og Cross Arts reaktivitet, især når ikke-konjugeret antistoffer anvendes. Flow cytometri, som består af frisk vævs behandling i en enkelt cellesuspension og mærkning med fluorescerende antistoffer har været guldstandarden for immunophenotyping i årtier^9,10. En fordel ved flow cytometri er evnen til at mærke flere antistoffer uden bekymring for Arts krydsreaktivitet, da de fleste er konjugeret. Fordi cellerne er “visualiseret” af en maskine og ikke menneskelige øjne, der er langt flere fluorophores til rådighed, men dette kommer med en omkostning. Kompensationen skal ske manuelt, hvilket i væsentlig grad kan ændre resultater, der producerer falske positive og negative populationer. Den væsentligste begrænsning af strømnings cytometri er, at vævs arkitekturen og efterfølgende alle rumlige oplysninger går tabt ved nødvendigheden af enkeltceller suspension.

Multiplex fluorescerende Immunhistokemi (mfIHC) ved hjælp af et automatiseret fluorescerende mikroskop kombineret med ny software kombinerer fordelene ved IHC, hvis og flow cytometri ved at tillade multi-antigen vævs farvning med signal forstærkning og fastholdelse af rumlige relationer uden behov for kompensation. FFPE-væv anbringes på ladede lysbilleder, som efter antigen-udtagning gennemgår en runde af primær antistof applikation til målantigen, efterfulgt af et sekundært antistof med et HRP-kemikalie mærke, der ligner IHC. Efter placeringen af det sekundære antistof resulterer en HRP-specifik reaktion i en fluoroforet, der er kovalent bindende for epitop af interesse¹¹. Når vævet er mærket, en anden runde af opvarmning slides er afsluttet fjerne den tidligere anvendte primære og sekundære antistof-kompleks efterlader kun fluorescerende tag bundet til vævet epitop¹¹. Dette giver mulighed for flere antistoffer af enhver art, der skal genappliceres uden bekymring for cross-reactivity^11,12. For at minimere behovet for manuel kompensation for flere fluorescerende farvestoffer, bruges en samling af fluorophorer med lille spektral overlap, herunder en atomart Counter plet, til at fuldføre mfIHC. For at gøre brug af den autofluorescens, der er opstået med FFPE-væv, trækker softwaren autofluorescens fra det endelige billede ved hjælp af et billede fra et tomt dias, som er muligt på grund af styrken af antigen specifik fluorescens efter fluoroforet signal forstærkning. Ved hjælp af nye programmer, der er designet til store datasæt, kan celleplaceringer identificeres og analyseres for rumlig kontekst^1,2,4. Den mest betydningsfulde begrænsning af denne teknik er optimering tid. Her findes en detaljeret metodologi med instruktioner til eksperimentel design og farvning og billedbehandlings strategi. mfIHC vil være nyttigt for laboratorier, der ikke i øjeblikket har en optimeret automatiseret farvning system, der gerne vil bedre forstå den rumlige kontekst af celle-til-celle interaktioner i intakt FFPE væv ved hjælp af manuel teknik.

Protocol

Alt arbejde er blevet godkendt af University of Michigans interne klagenævn. 1. optimering af primære antistoffer og slide forberedelse Bestem ideel koncentration af antistoffer for multiplex ved hjælp af konventionelle IHC. Test antistofferne for multiplex ved manuel konventionel immun histokemi (IHC)13. Brug specifikke væv, der har en rigelig celletype for hvert antistof testet såsom brug af tonsil væv til CD3 antistof test. B…

Representative Results

Den overordnede proces med at opnå en 7-farvet multiplex-analyse følger et gentaget mønster. Figur 1 beskriver processen i en skematisk form. Når slides er skåret og tørret eller modtages fra laboratoriet og bagt i en hybridiseringsovn ved 60 °c i 1 time, derefter gå videre til deparaffinisering og rehydrering, fastgør diasene i formalin igen efterfulgt af antigen hentning. Hver runde af multiplexing starter ved antigen hentning og slutter ved antistof fjernelse (<strong class="xfig…

Discussion

Intakte vævsprøver fra solid tumor biopsi og kirurgisk resektion er fortsat vigtige diagnostiske og forudsigende værktøjer til sygdoms analyse samt patient prognose. Multiplex fluorescerende immun histokemi (mfIHC) er en ny teknik, der kombinerer fordelene ved immun histokemi (IHC), immunofluorescens (IF) og flow cytometri. Tidligere metoder til sonde celler in situ har tilladt for evaluering af celle-til-celle arrangementer i et vævs miljø⁸, men det lave antal epitoper, der kan probed begr?…

Materials

100% ethanol	Fisher	HC8001GAL
70% ethanol	Fisher	HC10001GL
95% ethanol	Fisher	HC11001GL
Analysis software	Akoya Biosciences	CLS135783	inForm version 2.3.0
Antifade mountant	ThermoFisher	P36961	ProLong Diamond
Blocking solution	Vector	SP-6000	Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Life Sciences	A9647-100G
Cover Slips	Fisher	12-548-5E
Delicate task wipe	Kimberly-Clark	34120
Fluorescent diluent	Akoya Biosciences	ARD1A01EA	Opal TSA diluent
Fluorophore 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	1:100
Fluorophore 540	Akoya Biosciences	FP1494001KT	1:100
Fluorophore 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	1:100
Fluorophore 620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	1:100
Fluorophore 650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	1:100
Fluorophore 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	1:100
Fluorophore DAPI	Akoya Biosciences	FP1490	3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box	Tissue-Tek	25608-904	Plastic slide box-green
Humidified Chamber	Ibi Scientific	AT-12
Hybridization oven	FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen	Vector	H-4000	ImmEdge
Microscope	Perkin Elmer	CLS140089	Mantra quantitative pathology workstation
Microwave	Panasonic	NN-A661S	with inverter technology
Neutral buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4	10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR600	AR6
pH 9 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR900	AR9
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994	PBS
Plastic slide box	Tissue-Tek	25608-906
Plastic wrap	Fisher	NC9070936
Polysorbate 20	Fisher	BP337-800	Tween 20
Primary antibody CD163	Lecia	NCL-LCD163	1:400
Primary antibody CD3	Dako	A0452	1:400
Primary antibody CD8	Spring Bio	M5390	1:400
Primary antibody FOXP3	Dako	M3515	1:400
Primary antibody pancytokeratin	Cell Signaling	12653	1:500
Primary antibody PD-L1	Cell Signaling	13684	1:200
Secondary antibody	Akoya Biosciences	ARH1001EA	Opal polymer
Slide stain set	Electron Microscopy Sciences	6254001
Tris buffered saline	Corning	46-012-CM	TBS
Vertical slide rack	Electron Microscopy Sciences	50-294-72
Xylene	Fisher	X3P1GAL