Optimering, design och undvika fallgropar i manuella multiplex fluorescerande immunohistokemi

Summary

Multiplex fluorescerande immunohistokemi är en framväxande teknik som möjliggör visualisering av flera celltyper inom intakt formalin-fast, paraffin inbäddade (FFPE) vävnad. Presenteras är riktlinjer för att säkerställa en lyckad 7-Color multiplex med instruktioner för att optimera antikroppar och reagenser, förbereda diabilder, design och tips för att undvika vanliga problem.

Abstract

Mikromiljö utvärdering av intakt vävnad för analys av cell infiltration och rumslig organisation är avgörande för att förstå komplexiteten i sjukdomsprocesser. De princip tekniker som tidigare använts inkluderar immunohistokemi (IHC) och immunofluorescens (IF) som möjliggör visualisering av celler som en ögonblicksbild i tid med mellan 1 och 4 markörer. Båda teknikerna har brister inklusive svårighet färgning dåligt antigena mål och begränsningar i samband med kors arter reaktivitet. IHC är pålitlig och reproducerbar, men den typ av kemi och tillit till det synliga ljuset spektrumet gör det möjligt för endast ett fåtal markörer som ska användas och gör Co-lokalisering utmanande. Användning av om breddar potentiella markörer men vanligtvis förlitar sig på fryst vävnad på grund av den omfattande vävnad autofluorescence efter formalin fixering. Flödescytometri, en teknik som möjliggör samtidig märkning av flera epitoper, upphäver många av bristerna i IF och IHC, men behovet av att undersöka celler som en enda cellsuspension förlorar den rumsliga kontexten av celler kasta viktiga biologiska Relationer. Multiplex fluorescerande immunohistokemi (mfIHC) broar dessa tekniker möjliggör multi-epitop cellulära fenotypning i formalin fast paraffin inbäddade (FFPE) vävnad samtidigt bevara den övergripande mikromiljö arkitektur och rumsliga förhållandet mellan celler i intakt ostörd vävnad. Hög fluorescerande intensitet fluoroforer som kovalent bindning till vävnaden epitop möjliggör flera tillämpningar av primära antikroppar utan att oroa sig för artspecifika korsreaktivitet av sekundära antikroppar. Även om denna teknik har visat sig producera pålitliga och korrekta bilder för studier av sjukdom, processen för att skapa en användbar mfIHC färgning strategi kan vara tidskrävande och krävande på grund av omfattande optimering och design. För att göra robusta bilder som representerar korrekta cellulära interaktioner på plats och för att mildra optimerings perioden för manuell analys, presenteras här är metoder för bild beredning, optimering av antikroppar, multiplex design samt fel vanligt förekommande under infärgningsprocessen.

Introduction

Visualisering av en intakt tumör mikromiljö (TME) är viktigt att utvärdera inte bara cellulära infiltration i fasta maligniteter men cell till cell interaktioner samt. Multiplex fluorescerande immunohistokemi (mfihc) har vuxit fram som ett effektivt verktyg för multi-antigen fenotypning av celler i studiet av cancer och tillhörande sjukdomar^{1,2,3,4, 5,6,7}. Detta, i kombination med ny programvara och program som utformats för att analysera stora datamängder, möjliggör observation av komplexa interaktioner mellan cellerna^1,2,4. Den hastighetsbegränsande faktorn vid datainsamling är ofta kvaliteten på den färgade vävnaden före analysen.

Tidigare tekniker som används för att fenotyp celler i TME inkluderar immunohistokemi (IHC), immunofluorescens (IF) och flödescytometri alla som uppvisar betydande begränsningar. IHC använder formalin fast paraffin inbäddade (FFPE) vävnad sektioner som är deparaffinized och rehydreras innan de färgas av oftast en antikropp. Användning av pepparrots peroxidas (HRP) bunden sekundär antikropp och en kemisk reaktion möjliggör visualisering av en enda antigen epitop⁸. Medan IHC är tillförlitlig och utförs på FFPE vävnad som är lätt att arbeta med, begränsningar av synligt ljusspektrum innebär endast en eller två markörer kan vara tillförlitlig framstående och colocalization av antigener ganska svårt⁸. Ett sätt att expandera tillgängliga markörer och därför antigener som kan sonderade på en enda sektion är att byta till fluorescens som möjliggör användning av ett bredare spektrum av det visuella spektrumet. För om, fryst eller FFPE vävnad överförs till diabilder och antikroppar som konjugeras till olika fluoroforer. Även om detta ökar antalet antigener som kan probed, det finns flera viktiga begränsningar. Först, eftersom varje antikropp vanligtvis bara har en fluorophore bifogas, ljusstyrkan är ofta inte tillräckligt stark för att övervinna vävnad autofluorescence. Det är av denna anledning, de flesta om utförs på fryst vävnad som är dyrt att lagra och svårt att arbeta med. Ett begränsat antal fluorescerande taggar är tillgängliga för användning på grund av spektralöverlappning och kors arter reaktivitet, särskilt när icke-konjugerade antikroppar används. Flödescytometri, som består av färsk vävnad bearbetning till en enda cellsuspension och märkning med fluorescerande antikroppar har varit den gyllene standarden för immunfenotypning i årtionden^9,10. En fördel med flödescytometri är förmågan att märka flera antikroppar utan oro för Art Cross reaktivitet eftersom de flesta är konjugerade. Eftersom cellerna är “visualiseras” av en maskin och inte mänskliga ögon, det finns mycket mer fluoroforer tillgängliga men detta kommer med en kostnad. Ersättning måste göras manuellt som avsevärt kan förändra resultat som producerar falskt positiva och negativa populationer. Den mest betydande begränsningen av flödescytometri är att vävnads arkitektur och därefter all rumslig information förloras av nödvändigheten för encells suspension.

Multiplex fluorescerande immunohistokemi (mfIHC) med hjälp av en automatiserad fluorescerande Mikroskop i kombination med ny programvara kombinerar fördelarna med IHC, om och flödescytometri genom att tillåta multi-antigen vävnad färgning med signal förstärkning och bibehållande av rumsliga förhållanden utan behov av kompensation. FFPE-vävnad placeras på laddade diabilder som efter antigen hämtning genomgår en omgång primär antikropps applikation till målantigenen av intresse följt av en sekundär antikropp med en kemiskt märke av HRP, liknande IHC. Efter placeringen av den sekundära antikroppen, en HRP specifik reaktion resulterar i en fluorophore kovalent bindning till epitop av intresse¹¹. När vävnaden är märkt, en annan runda av värme bilderna är klar att ta bort den tidigare applicerade primära och sekundära antikropp komplex lämnar endast fluorescerande tagg bunden till vävnaden epitop¹¹. Detta gör att flera antikroppar av alla arter som skall appliceras på nytt utan oro för korreaktivitet^11,12. För att minimera alla behov av manuell kompensation av flera fluorescerande färgämnen, en samling av fluoroforer med liten spektralöverlappning inklusive en nukleär motverka fläcken används för att slutföra mfIHC. För att redogöra för autofluorescence stött på FFPE vävnad, programvara subtrafrar autofluorescence från den slutliga bilden med hjälp av en bild från en tom bild som är möjlig på grund av styrkan av antigen specifik fluorescens efter fluorophore signal förstärkning. Med hjälp av nya program som utformats för stora datamängder kan cell platser identifieras och analyseras för rumslig kontext^1,2,4. Den mest betydande begränsningen av denna teknik är optimerings tid. En detaljerad metod med instruktioner för experimentell design och färgning och avbildning strategi finns här. mfIHC kommer att vara användbart för laboratorier som för närvarande inte har ett optimerat automatiserat infärgnings system som skulle vilja bättre förstå den rumsliga kontexten av cell-till-cell interaktioner i intakt FFPE vävnad med hjälp av den manuella tekniken.

Protocol

Allt arbete har godkänts av University of Michigans interna granskningsnämnd. 1. optimera primära antikroppar och skjut preparatet Bestäm idealisk koncentration av antikroppar för multiplex med konventionell IHC. Testa antikropparna för multiplex genom manuell konventionell immunohistokemi (IHC)13. Använd specifika vävnader som har en riklig celltyp för varje antikropp som testats, såsom att använda tonsill vävnad för CD3 antikrop…

Representative Results

Den övergripande processen för att få en 7-Color multiplex assay följer ett repetitivt mönster. Figur 1 beskriver processen i ett diagramformat. När bilderna skärs och torkas eller tas emot från laboratoriet och bakas i en hybridisering ugn vid 60 ° c för 1 h, sedan gå vidare till avparaffinering och rehydrering, fixa bilderna i formalin igen följt av antigen hämtning. Varje omgång multiplexering börjar vid antigen hämtning och ytbehandlingar vid avlägsnande av antikroppar (…

Discussion

Intakta vävnadsprover från solid tumörbiopsi och kirurgisk resektion förblir viktiga diagnostiska och prediktiva verktyg för sjukdoms analys samt patient prognos. Multiplex fluorescerande immunohistokemi (mfIHC) är en ny teknik som kombinerar fördelarna med immunohistokemi (IHC), immunofluorescens (IF) och flödescytometri. Tidigare metoder för att sond celler in situ har tillåtit för utvärdering av cell-till-cell-arrangemang i en vävnads miljö⁸, dock, det låga antalet epitoper som k…

Materials

100% ethanol	Fisher	HC8001GAL
70% ethanol	Fisher	HC10001GL
95% ethanol	Fisher	HC11001GL
Analysis software	Akoya Biosciences	CLS135783	inForm version 2.3.0
Antifade mountant	ThermoFisher	P36961	ProLong Diamond
Blocking solution	Vector	SP-6000	Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Life Sciences	A9647-100G
Cover Slips	Fisher	12-548-5E
Delicate task wipe	Kimberly-Clark	34120
Fluorescent diluent	Akoya Biosciences	ARD1A01EA	Opal TSA diluent
Fluorophore 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	1:100
Fluorophore 540	Akoya Biosciences	FP1494001KT	1:100
Fluorophore 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	1:100
Fluorophore 620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	1:100
Fluorophore 650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	1:100
Fluorophore 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	1:100
Fluorophore DAPI	Akoya Biosciences	FP1490	3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box	Tissue-Tek	25608-904	Plastic slide box-green
Humidified Chamber	Ibi Scientific	AT-12
Hybridization oven	FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen	Vector	H-4000	ImmEdge
Microscope	Perkin Elmer	CLS140089	Mantra quantitative pathology workstation
Microwave	Panasonic	NN-A661S	with inverter technology
Neutral buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4	10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR600	AR6
pH 9 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR900	AR9
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994	PBS
Plastic slide box	Tissue-Tek	25608-906
Plastic wrap	Fisher	NC9070936
Polysorbate 20	Fisher	BP337-800	Tween 20
Primary antibody CD163	Lecia	NCL-LCD163	1:400
Primary antibody CD3	Dako	A0452	1:400
Primary antibody CD8	Spring Bio	M5390	1:400
Primary antibody FOXP3	Dako	M3515	1:400
Primary antibody pancytokeratin	Cell Signaling	12653	1:500
Primary antibody PD-L1	Cell Signaling	13684	1:200
Secondary antibody	Akoya Biosciences	ARH1001EA	Opal polymer
Slide stain set	Electron Microscopy Sciences	6254001
Tris buffered saline	Corning	46-012-CM	TBS
Vertical slide rack	Electron Microscopy Sciences	50-294-72
Xylene	Fisher	X3P1GAL