수동 멀티플렉스 형광 면역성 화학의 최적화, 설계 및 함정 방지
Summary
멀티플렉스 형광 면역 조직 화학은 그대로 포르말린 고정, 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 내에서 여러 세포 유형의 시각화를 가능하게하는 새로운 기술이다. 제시된 7색 멀티플렉스는 항체 및 시약을 최적화하고, 슬라이드를 준비하고, 일반적인 문제를 피하기 위한 설계 및 팁을 준비하기 위한 지침이 제시되어 있습니다.
Abstract
세포 침투 및 공간 조직의 분석을 위한 손상되지 않은 조직의 미세 환경 평가는 질병 과정의 복잡성을 이해하는 데 필수적입니다. 과거에 사용된 원리 기술은 1과 4 마커 사이를 사용하여 시간에 스냅샷으로 세포의 가시화를 가능하게 하는 면역성 결합 (IHC) 및 면역 형광 (IF)를 포함합니다. 두 기술 모두 불량 항원 표적 염색 어려움 및 종 간 반응성과 관련된 한계를 포함한 단점이 있습니다. IHC는 신뢰할 수 있고 재현 가능하지만 화학의 특성과 가시광선 스펙트럼에 대한 의존도는 소수의 마커만 사용할 수 있게 해주며 공동 현지화를 어렵게 만듭니다. IF의 사용은 잠재적인 마커를 넓히지 만 일반적으로 포르말린 고정 다음 광범위한 조직 자가 형광으로 인해 냉동 조직에 의존합니다. 유세포분석법은 여러 에피토프의 동시 라벨링을 가능하게 하는 기술로, IF와 IHC의 많은 결핍을 폐지하지만, 단일 세포 현탁액으로 세포를 검사할 필요성은 중요한 생물학적 제제를 버리는 세포의 공간적 맥락을 상실한다. 관계. 멀티플렉스 형광 면역조직화학(mfIHC)은 이러한 기술을 통해 전체적인 미세환경 구조및 공간적 구조를 보존하면서 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 조직에서 다중 에피토프 세포 자형질짝을 허용합니다. 그대로 중단되지 않은 조직 내의 세포의 관계. 조직 에피토프에 공유적으로 결합하는 높은 형광 강도 형광은 이차 항체에 의한 종 특정 교차 반응성에 대한 걱정없이 1 차 항체의 여러 응용 프로그램을 가능하게합니다. 이 기술은 질병 연구를 위해 신뢰할 수 있고 정확한 이미지를 생성하는 것으로 입증되었지만, 유용한 mfIHC 염색 전략을 만드는 과정은 광범위한 최적화 및 설계로 인해 시간과 정확할 수 있습니다. 현장에서 정확한 세포 상호 작용을 나타내는 견고한 이미지를 만들고 수동 분석을 위한 최적화 기간을 완화하기 위해 슬라이드 준비, 항체 최적화, 멀티플렉스 설계 및 오류를 위한 방법이 여기에 제시되어 있습니다. 염색 과정에서 일반적으로 발생합니다.
Introduction
손상되지 않은 종양 미세 환경 (TME)의 가시화는 고체 악성종양에서뿐만 아니라 세포 상호 작용에 세포 침투뿐만 아니라 세포 침투를 평가하는 데 필수적입니다. 멀티플렉스 형광 면역성화학(mfIHC)은 암 및 관련 질환의 연구에서 세포의 다항원 자형질에 효과적인 도구로부상하고 있다 1,2,3,4, 5,6,7. 이것은, 큰 데이터 세트를 분석하도록 설계된 새로운 소프트웨어 및 프로그램과 결합하여, 세포 사이의 복잡한 상호 작용의 관찰을 가능하게1,2,4. 데이터 수집의 속도 제한 요인은 종종 분석 전에 염색된 조직의 품질입니다.
TME에 있는 표현형 세포에 이용된 이전 기술은 면역성 결합 (IHC), 면역 형광 (IF) 및 유세포 세포 분석 이 모두 중요한 한계를 제시포함합니다. IHC는 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 조직 섹션을 사용하여 가장 자주 하나의 항체에 의해 염색되기 전에 분리되고 재수화됩니다. 고추냉이 과산화아제(HRP)의 사용은 이차 항체와 화학 반응을 결합하여 단일 항원 에피토프8의 가시화를 가능하게 한다. IHC는 신뢰할 수 있고 작동하기 쉬운 FFPE 조직에서 수행되지만, 가시광 스펙트럼에 대한 제한은 하나 또는 두 개의 마커만이신뢰할 수 있는 구별및 항원의 동국화가 매우 어렵다는 것을 의미한다. 단일 섹션에서 조사할 수 있는 사용 가능한 마커 및 따라서 항원을 확장하는 방법은 더 넓은 범위의 시각 스펙트럼을 사용할 수 있도록 형광으로 변경하는 것입니다. IF의 경우, 동결 또는 FFPE 조직은 다양한 형광체에 공액되는 슬라이드 및 항체로 옮겨질 수 있다. 이것은 조사될 수 있는 항원의 수를 증가하는 동안, 몇몇 중요한 한계가 있습니다. 첫째, 각 항체는 전형적으로 하나의 형광공만 부착되어 있기 때문에, 밝기는 종종 조직 자가형광을 극복할 만큼 충분히 강하지 않다. 이러한 이유로, 대부분의 IF는 저장 비용이 많이 들고 작업하기 어려운 냉동 조직에서 수행됩니다. 특히 비공액 항체가 사용될 때 스펙트럼 중복 및 교차 종 반응성으로 인해 제한된 수의 형광 태그를 사용할 수 있습니다. 단일 세포 현탁액으로 신선한 조직 처리및 형광 항체로 라벨링으로 구성된 유세포분석은 수십 년 동안 면역phenotaing을 위한 금 본위제9,10. 유세포 분석의 이점은 대부분의 것이 공액화되기 때문에 종 교차 반응성에 대한 우려없이 여러 항체에 라벨을 붙일 수 있다는 것입니다. 세포는 기계에 의해 “시각화”되고 인간의 눈이 아니기 때문에 훨씬 더 많은 형광단이 사용할 수 있지만 이것은 비용이 함께 제공됩니다. 보상은 거짓 긍정 및 부정적인 인구를 생성하는 결과를 크게 바꿀 수 있는 수동으로 수행해야 합니다. 유세포분석의 가장 중요한 한계는 조직 구조와 이후에 모든 공간 정보가 단일 세포 현탁액에 대한 필요성에 의해 손실된다는 것입니다.
새로운 소프트웨어와 결합된 자동 형광 현미경을 이용한 멀티플렉스 형광 면역조직화학(mfIHC)은 신호 증폭과 함께 다중 항원 조직 염색을 허용함으로써 IHC, IF 및 유세포분석의 이점을 결합하고 보상할 필요 없이 공간 관계를 유지합니다. FFPE 조직은 항원 검색 후 IHC와 유사한 HRP 화학 태그를 가진 이차 항체가 관심있는 표적 항원에게 1 차 항체 적용의 라운드를 거치는 충전 된 슬라이드에 배치됩니다. 이차 항체의 배치 후, HRP 특이적 반응은 관심있는 에피토프에 공유결합하여 형광공자(11)를 초래한다. 일단 조직이 표지되면, 슬라이드를 가열하는 또 다른 라운드는 조직 에피토프(11)에 결합된 형광 태그만을남기고 이전에 적용된 1차 및 2차 항체 복합체를 제거하는 것으로 완성된다. 이것은 교차 반응성11,12에대한 염려없이 임의의 종의 다중 항체가 재적용될 수 있게 한다. 다중 형광 염료의 수동 보상에 대한 필요성을 최소화하기 위해 핵 카운터 얼룩을 포함하여 스펙트럼이 거의 겹치는 형광단 컬렉션을 사용하여 mfIHC를 완료합니다. FFPE 조직과 마주치는 자가형광을 설명하기 위해 소프트웨어는 불소 후 항원 특이형광의 강도 때문에 가능한 빈 슬라이드에서 이미지를 사용하여 최종 이미지에서 자가형광을 뺍니다. 신호 증폭. 대용량 데이터 세트를 위해 설계된 새로운 프로그램을 사용하여 공간컨텍스트 1,2,4에대해 셀 위치를 식별하고 분석할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 제한사항은 최적화 시간입니다. 실험 설계 및 염색 및 이미징 전략에 대한 지침이 포함된 자세한 방법론이 여기에서 확인할 수 있습니다. mfIHC는 현재 수동 기술을 사용하여 본래 FFPE 조직에서 세포 간 상호 작용의 공간 적 맥락을 더 잘 이해하고 자하는 최적화 된 자동 염색 시스템이없는 실험실에 유용 할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
고형 종양 생검 및 외과 절제술에서 온전한 조직 견본은 환자 예후 뿐만 아니라 질병 분석을 위한 중요한 진단 그리고 예측 공구 남아 있습니다. 멀티플렉스 형광 면역히스토화학(mfIHC)은 면역성화학(IHC), 면역형광(IF) 및 유세포분석의 이점을 결합한 새로운 기술이다. 이전에는 세포가 있는 장소에서 세포를 프로브하는 방법들은 조직 환경에서 세포 간배열의 평가를 허용하였다 8…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 원래 멀티 플렉스 얼룩의 설정 및 최적화에 대한 그의 도움, 퍼킨 엘머에서 이전에 에드 스택에 감사드립니다. 저자는 또한 분석 소프트웨어를 사용하여 팁 아코야 바이오 사이언스에서 크리스틴 슈미트에게 감사하고 싶습니다. 이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 P30CA046592의 밑에 건강의 국가 암 학회에 의해 지원되었습니다, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA1515807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 추가 지원은 제프리 A. 콜비 결장암과 톰 리우 기념 연구 기금에 의해 제공되었다.
Materials
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
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