Optimalisering, design og unngå fallgruver i manuell multiplex fluorescerende immunhistokjemi

Summary

Multiplex fluorescerende immunhistokjemi er en ny teknologi som muliggjør visualisering av flere celletyper innenfor intakt formalin, parafin embedded (FFPE) vev. Presentert er retningslinjer for å sikre en vellykket 7-farge multiplex med instruksjoner for å optimalisere antistoffer og reagenser, forberede lysbilder, design og tips for å unngå vanlige problemer.

Abstract

Mikromiljøet evaluering av intakt vev for analyse av celle infiltrasjon og romlig organisasjon er avgjørende for å forstå kompleksiteten i sykdommen prosesser. Prinsippet teknikker som brukes i fortiden inkluderer immunhistokjemi (IHC) og immunofluorescence (IF) som muliggjør visualisering av celler som et øyeblikksbilde i tid ved hjelp av mellom 1 og 4 markører. Begge teknikkene har svakheter inkludert problemer farging dårlig antigen mål og begrensninger knyttet til kryss-arter reaktivitet. IHC er pålitelig og reproduserbar, men arten av kjemi og avhengighet av det synlige lyset spekteret gir bare noen få markører som skal brukes og gjør co-lokalisering utfordrende. Bruk av IF utvider potensielle markører, men vanligvis er avhengig av frosset vev på grunn av den omfattende vev autofluorescence etter formalin fiksering. Flow flowcytometri, en teknikk som muliggjør samtidig merking av flere epitopes, opphever mange av manglene ved IF og IHC, men behovet for å undersøke celler som en enkelt celle suspensjon mister romlige konteksten av celler forkaste viktige biologiske Relasjoner. Multiplex fluorescerende immunhistokjemi (mfIHC) broer disse teknologiene muliggjør multi-epitope mobilnettet bestemmelse av fenotype i formalin fast parafin embedded (FFPE) vev samtidig bevare den samlede mikromiljøet arkitektur og romlig forholdet mellom celler i intakt uforstyrret vev. Høy fluorescerende intensitet fluorophores som covalently bånd til vevet epitope muliggjør flere anvendelser av primære antistoffer uten bekymring for arter spesifikke kryss-reaktivitet av sekundære antistoffer. Selv om denne teknologien har vist seg å produsere pålitelige og nøyaktige bilder for studiet av sykdom, kan prosessen med å lage en nyttig mfIHC farging strategi være tidkrevende og krevende på grunn av omfattende optimalisering og design. For å gjøre robuste bilder som representerer nøyaktige mobilnettet interaksjoner in-situ og å redusere optimaliserings perioden for manuell analyse, som presenteres her er metoder for lysbilde forberedelse, optimalisere antistoffer, multiplex design samt feil ofte oppstår under fargeprosessen.

Introduction

Visualisering av en intakt tumor mikromiljøet (TME) er viktig i å evaluere ikke bare cellulære infiltrasjon i solid ondartet men celle til celle interaksjoner også. Multiplex fluorescerende immunhistokjemi (mfIHC) har dukket opp som et effektivt verktøy for multi-antigen bestemmelse av fenotype av celler i studiet av kreft og tilhørende sykdommer^1,2,3,^{4, 5,6,7}. Dette, i kombinasjon med romanen programvare og programmer som er utviklet for å analysere store datasett, muliggjør observasjon av komplekse interaksjoner mellom cellene^1,2,4. Satsen begrensende faktor i datainnhenting er ofte kvaliteten på farget vev før analyse.

Tidligere teknikker som brukes til å fenotype celler i TME inkluderer immunhistokjemi (IHC), immunofluorescence (IF) og Flow flowcytometri som alle utgjør betydelige begrensninger. IHC bruker formalin faste parafin embedded (FFPE) vev seksjoner som er deparaffinized og rehydrert før de blir farget av oftest ett antistoff. Bruk av et pepperrot peroksidase (HRP) bundet sekundært antistoff og en kjemisk reaksjon tillater visualisering av en enkelt antigen epitope⁸. Mens IHC er pålitelig og utført på FFPE vev som er lett å arbeide med, begrensninger til det synlige lyset spekteret betyr bare en eller to markører kan være pålitelig skilles og colocalization av antigener ganske vanskelig⁸. En måte å utvide tilgjengelige markører og derfor antigener som kan være analysert på en enkelt seksjon er å bytte til fluorescens som tillater bruk av et bredere spekter av det visuelle spekteret. For IF, frosset eller FFPE vev overføres til lysbilder og antistoffer som brukes som er bøyd til ulike fluorophores. Selv om dette øker antall antigener som kan være analysert, er det flere viktige begrensninger. Først fordi hvert antistoff vanligvis bare har en fluoroforen vedlagt, lysstyrken er ofte ikke sterk nok til å overvinne vev autofluorescence. Det er av denne grunn, de fleste IF er utført på frossen vev som er dyrt å lagre og vanskelig å arbeide med. Et begrenset antall fluorescerende etiketter er tilgjengelig for bruk på grunn av Spectral overlapping og kryss arter reaktivitet spesielt når ikke-bøyd antistoffer brukes. Flow flowcytometri, som består av fersk vevs behandling i en enkelt celle suspensjon og merking med fluorescerende antistoffer har vært gullstandarden for immunfenotyping i flere ti år^9,10. En fordel med strømnings flowcytometri er evnen til å merke flere antistoffer uten bekymring for at arter krysser reaktivitet, ettersom de fleste blir bøyd. Fordi cellene er “visualisere” av en maskin og ikke menneskelige øyne, det er langt mer fluorophores tilgjengelig, men dette kommer med en kostnad. Kompensasjon må gjøres manuelt som kan betydelig endre resultater produsere falske positive og negative populasjoner. Den mest vesentlige begrensningen av Flow flowcytometri er at vev arkitektur og deretter all romlig informasjon er tapt ved nødvendigheten av enkeltceller suspensjon.

Multiplex fluorescerende immunhistokjemi (mfIHC) ved hjelp av et automatisert fluorescerende mikroskop i kombinasjon med ny programvare kombinerer fordelene med IHC, IF og Flow flowcytometri ved at multi-antigen vev farging med signal forsterkning og oppbevaring av romlige forhold uten behov for kompensasjon. FFPE vev plasseres på ladet lysbilder som etter antigen henting, gjennomgår en runde av primær antistoff søknad til målet antigen av interesse etterfulgt av et sekundært antistoff med en HRP kjemisk kode, lik IHC. Etter plassering av sekundær antistoff, en HRP spesifikk reaksjon resulterer i en fluoroforen covalently binding til epitope av interesse¹¹. Når vevet er merket, en ny runde av oppvarming lysbildene er fullført fjerne tidligere anvendt primære og sekundære antistoff kompleks slik at bare den fluorescerende koden bundet til vevet epitope¹¹. Dette gjør det mulig for flere antistoffer av alle arter som kan brukes på nytt uten bekymring for kryss-reaktivitet^11,12. For å minimere behovet for manuell kompensasjon av flere fluorescerende fargestoffer, brukes en samling av fluorophores med liten Spectral overlapping inkludert en kjernefysisk Counter flekken til å fullføre mfIHC. Å gjøre rede for det autofluorescence støtt på med FFPE tissue, programvare trekker det autofluorescence fra det final image benytter en image fra en fjerne skyve hvilke er mulig med hensyn til styrken av antigen spesifikk fluorescens fulgte fluoroforen signal forsterkning. Ved hjelp av romanen programmer laget for store datasett, celle steder kan identifiseres og analyseres for romlig kontekst^1,2,4. Den mest vesentlige begrensningen av denne teknikken er optimaliserings tid. Her finner du en detaljert metodikk med instruksjoner for eksperimentell design og farge-og bildebehandlings strategi. mfIHC vil være nyttig for laboratorier som ikke har en optimalisert automatisert farging system som ønsker å bedre forstå romlig sammenheng med celle-til-celle interaksjoner i intakt FFPE vev ved hjelp av manuell teknikk.

Protocol

Alt arbeid har blitt godkjent av University of Michigan interne gjennomgang styret. 1. optimalisere primære antistoffer og Slide forberedelse Bestem ideell konsentrasjon av antistoffer for multiplex ved bruk av konvensjonell IHC. Test antistoffer for multiplex ved manuell konvensjonell immunhistokjemi (IHC)13. Bruk spesifikke vev som har en rikelig celle type for hver antistoff testet som bruker mandel vev for CD3 antistoff testing. …

Representative Results

Den generelle prosessen med å få en 7-farge multiplex analysen følger en repeterende mønster. Figur 1 beskriver prosessen i et diagrammatisk skjema. Når lysbildene er kuttet og tørket eller er mottatt fra laboratoriet og bakt i en hybridisering ovn ved 60 ° c for 1 t, deretter gå videre til deparaffinization og rehydrering, fikse lysbildene i formalin igjen etterfulgt av antigen henting. Hver runde med multipleksing starter på antigen og fullfører ved fjerning av antistoff (<strong…

Discussion

Intakt vevsprøver fra solid tumor biopsi og kirurgiske reseksjon er fortsatt viktig diagnostiske og prediktiv verktøy for sykdoms analyse, samt pasient prognose. Multiplex fluorescerende immunhistokjemi (mfIHC) er en ny teknikk som kombinerer fordelene ved immunhistokjemi (IHC), immunofluorescence (IF) og Flow flowcytometri. Tidligere metoder for å granske celler in situ har tillatt for evaluering av celle-til-celle-ordninger i et vev miljø⁸, men det lave antallet epitopes som kan være analys…

Materials

100% ethanol	Fisher	HC8001GAL
70% ethanol	Fisher	HC10001GL
95% ethanol	Fisher	HC11001GL
Analysis software	Akoya Biosciences	CLS135783	inForm version 2.3.0
Antifade mountant	ThermoFisher	P36961	ProLong Diamond
Blocking solution	Vector	SP-6000	Bloxall
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Life Sciences	A9647-100G
Cover Slips	Fisher	12-548-5E
Delicate task wipe	Kimberly-Clark	34120
Fluorescent diluent	Akoya Biosciences	ARD1A01EA	Opal TSA diluent
Fluorophore 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	1:100
Fluorophore 540	Akoya Biosciences	FP1494001KT	1:100
Fluorophore 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	1:100
Fluorophore 620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	1:100
Fluorophore 650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	1:100
Fluorophore 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	1:100
Fluorophore DAPI	Akoya Biosciences	FP1490	3 drops in TBST or PBS
Heat resistant box	Tissue-Tek	25608-904	Plastic slide box-green
Humidified Chamber	Ibi Scientific	AT-12
Hybridization oven	FisherBiotech
Hydrophobic barrier pen	Vector	H-4000	ImmEdge
Microscope	Perkin Elmer	CLS140089	Mantra quantitative pathology workstation
Microwave	Panasonic	NN-A661S	with inverter technology
Neutral buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4	10% neutral buffered formalin
pH 6 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR600	AR6
pH 9 antigen retrieval buffer	Akoya Biosciences	AR900	AR9
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994	PBS
Plastic slide box	Tissue-Tek	25608-906
Plastic wrap	Fisher	NC9070936
Polysorbate 20	Fisher	BP337-800	Tween 20
Primary antibody CD163	Lecia	NCL-LCD163	1:400
Primary antibody CD3	Dako	A0452	1:400
Primary antibody CD8	Spring Bio	M5390	1:400
Primary antibody FOXP3	Dako	M3515	1:400
Primary antibody pancytokeratin	Cell Signaling	12653	1:500
Primary antibody PD-L1	Cell Signaling	13684	1:200
Secondary antibody	Akoya Biosciences	ARH1001EA	Opal polymer
Slide stain set	Electron Microscopy Sciences	6254001
Tris buffered saline	Corning	46-012-CM	TBS
Vertical slide rack	Electron Microscopy Sciences	50-294-72
Xylene	Fisher	X3P1GAL