Optimisation, conception et éviter les pièges dans l'immunohistochimie fluorescente du multiplex manuel
Summary
L’immunohistochimie fluorescente multiplex est une technologie émergente qui permet la visualisation de plusieurs types de cellules dans le tissu intact de formaline-fixe, incorporé de paraffine (FFPE). Présentés sont des lignes directrices pour assurer un multiplexe 7-couleur réussie avec des instructions pour optimiser les anticorps et les réactifs, la préparation des diapositives, la conception et des conseils pour éviter les problèmes communs.
Abstract
L’évaluation de microenvironnement du tissu intact pour l’analyse de l’infiltration cellulaire et de l’organisation spatiale est essentielle pour comprendre la complexité des processus de la maladie. Les principales techniques utilisées dans le passé comprennent l’immunohistochimie (IHC) et l’immunofluorescence (IF) qui permettent la visualisation des cellules comme un instantané dans le temps en utilisant entre 1 et 4 marqueurs. Les deux techniques présentent des lacunes, notamment des difficultés à colorer des cibles mal antigéniques et des limitations liées à la réactivité inter-espèces. Le CSI est fiable et reproductible, mais la nature de la chimie et la dépendance à l’égard du spectre de la lumière visible ne permettent d’utiliser que quelques marqueurs et rendent la colocalisation difficile. L’utilisation de IF élargit les marqueurs potentiels, mais repose généralement sur le tissu congelé en raison de l’autofluorescence tissulaire étendue après fixation formaline. La cytométrie de flux, une technique qui permet l’étiquetage simultané des épitopes multiples, abroge beaucoup des insuffisances de IF et iHC, cependant, la nécessité d’examiner des cellules comme une suspension de cellules simples perd le contexte spatial des cellules rejetant le biologique important Relations. Multiplex immunohistochemistry fluorescent (mfIHC) ponts ces technologies permettant de phénotypage cellulaire multi-épitographié dans la formaline paraffine intégrée (FFPE) tissu tout en préservant l’architecture microenvironnement globale et spatiale relation des cellules dans le tissu intact non perturbé. Les fluorophores à haute intensité fluorescente qui se lient de façon covalente à l’épitotome tissulaire permettent de multiples applications d’anticorps primaires sans se soucier de la réactivité croisée spécifique des espèces par des anticorps secondaires. Bien que cette technologie ait été prouvée pour produire des images fiables et précises pour l’étude de la maladie, le processus de création d’une stratégie utile de coloration mfIHC peut être long et exigeant en raison de l’optimisation et la conception étendues. Afin de faire des images robustes qui représentent des interactions cellulaires précises in situ et d’atténuer la période d’optimisation pour l’analyse manuelle, présentés ici sont des méthodes pour la préparation des diapositives, l’optimisation des anticorps, la conception des multiplexes ainsi que des erreurs couramment rencontrés au cours du processus de coloration.
Introduction
La visualisation d’un microenvironnement intact de tumeur (TME) est essentielle en évaluant non seulement l’infiltration cellulaire dans les malignités pleines mais les interactions de cellules à cellules aussi bien. Multiplex immunohistochemistry fluorescent (mfIHC) a émergé comme un outil efficace pour le phénotypage multi-antigène des cellules dans l’étude du cancer et des maladies associées1,2,3,4, 5,6,7. Ceci, en combinaison avec de nouveaux logiciels et programmes conçus pour analyser de grands ensembles de données, permet l’observation des interactions complexes entre les cellules1,2,4. Le facteur limitant le taux dans l’acquisition de données est souvent la qualité du tissu taché avant l’analyse.
Les techniques précédentes utilisées pour phénotype des cellules dans le TME incluent l’immunohistochimie (IHC), l’immunofluorescence (IF) et la cytométrie de flux qui présentent toutes des limitations significatives. IHC utilise des sections de tissu incrustés de paraffine fixe de formaline (FFPE) qui sont déparaffinisées et réhydratées avant d’être tachées par le plus souvent un anticorps. L’utilisation d’un anticorps secondaire lié au raifort (HRP) et d’une réaction chimique permet la visualisation d’une seule épitope antigénique8. Bien que le CiSE soit fiable et exécuté sur le tissu FFPE qui est facile à travailler avec, les limitations au spectre de lumière visible signifie que seulement un ou deux marqueurs peuvent être distingués fiables et colocalisation des antigènes tout à fait difficile8. Une façon d’élargir les marqueurs disponibles et donc les antigènes qui peuvent être sondés sur une seule section est de passer à la fluorescence qui permet l’utilisation d’une plus large gamme du spectre visuel. Pour le tissu FI, congelé ou FFPE est transféré sur des lames et des anticorps utilisés qui sont conjugués à divers fluorophores. Bien que cela augmente le nombre d’antigènes qui peuvent être sondés, il ya plusieurs limitations importantes. Tout d’abord, parce que chaque anticorps n’a généralement qu’un seul fluorophore attaché, la luminosité n’est souvent pas assez forte pour surmonter l’autofluorescence des tissus. C’est pour cette raison, la plupart des IF est effectuée sur des tissus congelés qui est coûteux à stocker et difficile à travailler avec. Un nombre limité d’étiquettes fluorescentes sont disponibles pour une utilisation en raison du chevauchement spectral et de la réactivité des espèces croisées, en particulier lorsque des anticorps non conjugués sont utilisés. La cytométrie de flux, qui consiste en un traitement des tissus frais en une seule suspension cellulaire et l’étiquetage avec des anticorps fluorescents a été l’étalon-or de l’immunophénotypage depuis des décennies9,10. Un avantage de la cytométrie de flux est la capacité d’étiqueter plusieurs anticorps sans se soucier de la réactivité croisée des espèces, car la plupart sont conjugués. Parce que les cellules sont «visualisées» par une machine et non les yeux humains, il ya beaucoup plus de fluorophores disponibles, mais cela vient avec un coût. L’indemnisation doit être faite manuellement, ce qui peut modifier considérablement les résultats produisant des populations faussement positives et négatives. La limitation la plus significative de la cytométrie de flux est que l’architecture tissulaire et, par la suite, toutes les informations spatiales sont perdues par la nécessité d’une suspension des cellules individuelles.
L’immunohistochimie fluorescente multiplex (mfIHC) à l’aide d’un microscope fluorescent automatisé en combinaison avec un nouveau logiciel combine les avantages de la cytométrie IHC, IF et flow en permettant la coloration des tissus multi-antigènes avec amplification du signal et la conservation des relations spatiales sans avoir besoin d’une compensation. Le tissu FFPE est placé sur des glissières chargées qui, après la récupération d’antigène, subissent une série d’application d’anticorps primaires à l’antigène cible d’intérêt suivi d’un anticorps secondaire avec une étiquette chimique HRP, semblable à IHC. Après le placement de l’anticorps secondaire, une réaction spécifique HRP se traduit par un fluorophore covalently liant à l’épitopie d’intérêt11. Une fois que le tissu est étiqueté, un autre cycle de chauffage des diapositives est terminé en supprimant le complexe d’anticorps primaire et secondaire précédemment appliqué laissant seulement l’étiquette fluorescente liée à l’épitotoe de tissu11. Cela permet de réappliquer de multiples anticorps de toute espèce sans se soucier de la réactivité croisée11,12. Pour minimiser tout besoin de compensation manuelle de colorants fluorescents multiples, une collection de fluorophores avec peu de chevauchement spectral, y compris une tache de compteur nucléaire est utilisé pour compléter le mfIHC. Pour tenir compte de l’autofluorescence rencontrée avec le tissu FFPE, le logiciel soustrait l’autofluorescence de l’image finale à l’aide d’une image à partir d’une diapositive vierge qui est possible en raison de la force de la fluorescence spécifique à l’antigène après fluorophore l’amplification du signal. À l’aide de nouveaux programmes conçus pour de grands ensembles de données, les emplacements cellulaires peuvent être identifiés et analysés pour le contexte spatial1,2,4. La limitation la plus importante de cette technique est le temps d’optimisation. Une méthodologie détaillée avec des instructions pour la conception expérimentale et la coloration et la stratégie d’imagerie se trouve ici. mfIHC sera utile pour les laboratoires qui ne disposent pas actuellement d’un système de coloration automatisé optimisé qui souhaite mieux comprendre le contexte spatial des interactions cellule-cellule dans le tissu FFPE intact à l’aide de la technique manuelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les spécimens intacts de tissu de la biopsie pleine de tumeur et de la résection chirurgicale restent les outils diagnostiques et prédictifs importants pour l’analyse de la maladie aussi bien que le pronostic patient. L’immunohistochimie fluorescente multiplex (mfIHC) est une technique nouvelle qui combine les avantages de l’immunohistochimie (IHC), de l’immunofluorescence (IF) et de la cytométrie de flux. Les méthodes précédentes pour sonder les cellules in situ ont permisl’évaluation des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tient à remercier Ed Stack, précédemment de Perkin Elmer, pour son aide à la configuration et l’optimisation de la coloration multiplexe d’origine. Les auteurs souhaitent également remercier Kristen Schmidt d’Akoya Biosciences pour les conseils à l’aide du logiciel d’analyse. La recherche publiée dans cette publication a été appuyée par les National Cancer Institutes of Health sous le numéro de prix P30CA046592, K08CA201581(tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA2414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health. Jeffery A. Colby Colon Cancer et Tom Liu Memorial Research Funds ont fourni un soutien supplémentaire.
Materials
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
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