Måling af spredning af vaskulære glatte muskelceller ved hjælp af Click Chemistry

Summary

Spredning er en kritisk del af cellulær funktion, og en fælles udlæser bruges til at vurdere potentielle toksicitet af nye lægemidler. Måling af spredning er derfor en hyppigt anvendt analyse i cellebiologi. Her præsenterer vi en enkel, alsidig metode til måling af spredning, der kan anvendes i vedlige og ikke-vedlige celler.

Abstract

Evnen af en celle til at formere sig er en integrerende del af den normale funktion af de fleste celler, og dysregulering af spredning er kernen i mange sygdomsprocesser. Af disse grunde er måling af spredning et fælles værktøj, der anvendes til at vurdere celle funktionen. Celle proliferation kan måles ved blot at tælle; Dette er imidlertid et indirekte middel til at måle spredning. Et almindeligt middel til direkte påvisning af celler, der forbereder sig på at opdele, er ved inkorporering af mærkede nukleosid-analoner. Disse omfatter den radioaktive nukleosid analog ³H-thymidin plus ikke-radioaktive nukleosid analoner såsom 5-brom-2 ‘ og (brdu) og 5-ethynyl-2′-og (EdU). Inkorporering af EdU opdages ved at klikke kemi, som har flere fordele i forhold til BrdU. I denne betænkning fremlægger vi en protokol til måling af spredning ved inkorporering af EdU. Denne protokol indeholder muligheder for forskellige udlæsninger, sammen med fordele og ulemper ved hver. Vi diskuterer også steder, hvor protokollen kan optimeres eller ændres for at imødekomme de specifikke behov i det planlagte eksperiment. Endelig, vi rører på de måder, at denne grundlæggende protokol kan ændres til måling af andre celle metabolitter.

Introduction

Spredning er en kritisk del af cellulære funktion^1,2. Kontrol af spredning påvirker normale processer såsom udvikling, og patologiske processer såsom kræft og hjerte-kar-sygdom. Hyperplastisk vækst af vaskulære glatte muskelceller, for eksempel, menes at være en forløber for åreforkalkning³. Ændringer i celle spredning anvendes også til at vurdere potentiel toksicitet af nye lægemidler. I betragtning af dens udbredte virkning er måling af spredning en grundpille i mange cellebiologi-baserede laboratorier.

Celle spredning kan måles ved blot at tælle celler, hvis celle populationen af interesse dividerer ret hurtigt. For langsommere vækst celler kan celletal være mindre følsomt. Spredning måles ofte ved inkorporering af mærkede nukleosid analover. Selv om guldstandarden er ³H-thymidin inkorporering, mange laboratorier er at komme væk fra denne metode i betragtning af tilgængeligheden af nyere, ikke-radioaktive alternativer. Disse omfatter cytoplasmiske fluorescerende farvestoffer, påvisning af celle cyklus associerede proteiner, og inkorporering af ikke-radioaktive nukleosid analoner såsom 5-brom-2 ‘ og (brdu) og 5-ethynyl-2′-og (EdU)⁴.

Cytoplasmiske farvestoffer, såsom carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFSE), detektere spredning, fordi intensiteten af farvestoffet halvdele hver gang cellen deler⁵. Denne teknik er almindeligt anvendt i flow cytometri for ikke-vedlige celler. Det har ikke været brugt meget for vedlige celler, men med den nye generation af billedplade læsere dette kan ændre sig. Påvisning af celle cyklus associerede proteiner gennem antistof-baserede teknikker (flow cytometri, immun histokemi, etc.) bruges ofte til væv eller ikke-vedhørende celler. Disse celler/væv skal fastgøres og permeabiliseres før farvning. Nukleosid analover BrdU og EdU er ens i tilgang til ³H-thymidin, men uden besværet med radioaktivitet. Inkorporering af BrdU påvises ved anti-BrdU antistoffer, og derfor skal cellerne fastgøres og permeabilized før farvning. Desuden skal cellerne behandles med DNase for at afsløre BrdU epitope.

Inkorporering af EdU detekteres ved at klikke kemi, hvor eller og Azid grupper “Klik” sammen i nærværelse af katalytisk kobber. Begge grupper kan fungere som det biosynthetisk indarbejdet molekyle eller detekterings molekyle⁴. Kommercielt tilgængelige nukleosid analoner har eller gruppen vedhæftet. For sprednings assays detekteres eller-funktionaliserede nukleosid analog ved en Azid, der er konjugeret til et fluorescerende farvestof eller en anden markør. Inkorporering af EdU har flere fordele i forhold til BrdU. For det første, fordi eller-og Azid-grupper ikke findes i pattedyrsceller, er denne interaktion meget specifik med en lav baggrund⁶. Da begge grupper er små, behøver cellerne ikke at gennemgå DNA-denaturering for at udsætte nukleosid-analog som krævet for BrdU⁷. Endelig, klik kemi er meget alsidig, og kan bruges til metabolisk mærkning af DNA, RNA, protein, fedtsyrer, og kulhydrater^8,9,10,11. Hvis det metabolisk mærkede mål af interesse er på cellens overflade, kan levende celler mærkes¹². Derudover kan cellerne forarbejdes yderligere til immunfluorescent farvning med antistoffer.

Følgende protokol beskriver brugen af EdU inkorporering og klik kemi at måle spredning i humane vaskulære glatte muskelceller (figur 1). Vi viser tre forskellige måder inkorporering af EdU kan måles, repræsentative resultater fra hver, og deres fordele og ulemper. Måling af spredning via Klik kemi er især nyttig for klædige, langsommere voksende celler. Desuden er den morfologi af cellen velholdt og antistof-baseret farvning kan også udføres.

Protocol

1. påvisning af EdU ved hjælp af fluorescerende label Stam løsninger Forbered en 5 mM EdU-stamopløsning ved at tilsætte 12,5 mg EdU til 10 mL dobbeltdestilleret H2O. Klargør komponenterne til mærknings løsningen: 200 mM tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Amin (THPTA) (100 mg i 1,15 mL H2o), 100 mm CuSO4 (15,95 mg i 1 ml h2o; Lav frisk), 10 mm Cy3 picolyl-azid (1 mg i 95,3 ml h2o , opbevaret i 5 μL aliquoter ved-20 °C) og 1 M …

Representative Results

I figur 2viser vi resultaterne af tre forskellige eksperimenter, som måler udbredelsen af VSMC som svar på PDGF. Efter dyrkning af cellerne i medierne formuleret til SMCs, vi udførte forsøget i serum fri DMEM, at eliminere eventuelle virkninger af serum eller vækstfaktorer på spredning. I figur 2a sammenligner vi resultater, fra det samme eksperiment, ved hjælp af en fluorescerende vs lysende viser udlæser. For at læse disse plader brugte vi en mikropla…

Discussion

Inkorporering af EdU er en enkel og ligetil måde at målecelle spredning på; Det er især nyttigt for vedsiddende celler¹³. Vores protokol bruger glatte muskelceller, men det gælder for enhver overholder celle (epitelial, endotelal, etc.). Selv om protokollen ikke er kompliceret, det ene kritiske skridt er at gøre mærkningen løsning-ingredienserne skal tilføjes i den anførte rækkefølge. Hertil kommer, ligesom kemiluminescens Western blots, hvis du bruger luminescens udlæsning pladen ska…

Materials

5-Ethynyl-2'-deoxyuridine	Carbosynth	NE08701
biotin picolyl azide	Click Chemistry Tools	1167-5
CuSO4	Fisher Scientific	C1297-100G
Cy3 picolyl azide	Click Chemistry Tools	1178-1
Cytation Plate Reader	Biotek
EVOS Microscope	Thermo Fisher Scientific
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763
Na ascorbate	Sigma-Aldrich	11140-250G
NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes	Invitrogen	R37606	DAPI nuclear stain
Odyssey Blocking Buffer	Li-Cor	927-40000	blocking buffer
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	15710
PBS	Fisher Scientific	SH3002802
Sodium Chloride	Sigma Life Science	S3014-5kg
Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate	Life Technologies	S911
Super Signal ELISA Femto	Thermo Scientific	PI137075	ELISA substrate
Synergy Plate Reader	Biotek
THPTA	Click Chemistry Tools	1010-100
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)	Fisher Scientific	BP153-500
Triton X 100	Bio-Rad	1610407
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100