A proliferação é uma parte crítica da função celular, e uma leitura comum usada para avaliar a toxicidade potencial de novos medicamentos. A medição da proliferação é, portanto, um ensaio freqüentemente usado na biologia celular. Aqui apresentamos um método simples e versátil de medição da proliferação que pode ser usado em células aderentes e não aderentes.
A capacidade de uma célula para proliferar é parte integrante da função normal da maioria das células, e a desregulação da proliferação está no coração de muitos processos de doença. Por estas razões, medir a proliferação é uma ferramenta comum usada para avaliar a função celular. A proliferação celular pode ser medida simplesmente pela contagem; no entanto, este é um meio indireto de medir a proliferação. Um meio comum de detectar diretamente as células se preparando para dividir é a incorporação de análogos nucleosídeos rotulados. Estes incluem o análogo radioradioativo do nucleosídeo 3H-thymidine mais análogos não radioativos do nucleosside tais como o deoxyuridine de 5 bromo-2′ (BrdU) e 5-etilnyl-2′-deoxyuridine (EdU). A incorporação da EdU é detectada pela química do clique, que tem várias vantagens quando comparada à BrdU. Neste relatório, fornecemos um protocolo para medir a proliferação pela incorporação da EdU. Este protocolo inclui opções para várias leituras, juntamente com as vantagens e desvantagens de cada um. Também discutimos locais onde o protocolo pode ser otimizado ou alterado para atender às necessidades específicas do experimento planejado. Finalmente, tocamos nas maneiras que este protocolo básico pode ser modificado para medir outros metabólitos celulares.
A proliferação é uma parte crítica da função celular1,2. O controle da proliferação influencia processos normais, como desenvolvimento e processos patológicos, como câncer e doenças cardiovasculares. Acredita-se que o crescimento hiperplástico das células musculares lisas vasculares, por exemplo, seja um precursor da aterosclerose3. Mudanças na proliferação celular também são usadas para avaliar a toxicidade potencial de novos medicamentos. Dado o seu impacto generalizado, medir a proliferação é um pilar de muitos laboratórios baseados em biologia celular.
A proliferação celular pode ser medida simplesmente pela contagem de células se a população celular de interesse se dividir rapidamente. Para células de crescimento mais lento, a contagem de células pode ser menos sensível. A proliferação é muitas vezes medida pela incorporação de análogos nucleosídeos rotulados. Embora o padrão ouro seja a incorporação 3H-thymidine, muitos laboratórios estão fugindo desse método, dada a disponibilidade de alternativas mais novas e não radioativas. Estes incluem corantes fluorescentes citoplasmais, detecção de proteínas associadas ao ciclo celular e incorporação de análogos de nucleosídeos não radioativos, como deoxiuridina (BrdU) 5-bromo-2′ e 5-etilnyl-2′-deoxyuridine (EdU)4.
Corantes citoplasmais, como carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE), detectam proliferação porque a intensidade do corantes metades cada vez que a célula divide5. Esta técnica é comumente usada em citometria de fluxo para células não aderentes. Não foi usado muito para pilhas aderentes, mas com a geração nova de leitores da placa da imagem latente isto pode mudar. A detecção de proteínas associadas ao ciclo celular através de técnicas baseadas em anticorpos (citometria de fluxo, imunohistoquímica, etc.) é frequentemente usada para tecidos ou células não aderentes. Estas células/tecidos devem ser fixadas e permeabilizadas antes da coloração. Os análogos de nucleosídeo BrdU e EdU são semelhantes na aproximação a 3H-thymidine, mas sem a inconveniência da radioatividade. A incorporação da BrdU é detectada por anticorpos anti-BrdU e, portanto, as células devem ser fixas e permeabilizadas antes da coloração. Além disso, as células devem ser tratadas com DNAse para expor o epítopo brdu.
A incorporação da EdU é detectada pela química do clique, na qual os grupos de alquino e azida “clicam” juntos na presença de cobre catalítico. Um ou outro grupo pode serir como a molécula biossintética incorporada ou a molécula4da deteção. Análogos nucleosídeos comercialmente disponíveis têm o grupo de alquin. Para ensaios de proliferação, portanto, o análogo nucleosídeo funcionalizado de alquino é detectado por um azide conjugado a um corante fluorescente ou outro marcador. A incorporação da EdU tem várias vantagens sobre a BrdU. Primeiro, como os grupos de alquino e azida não são encontrados em células de mamíferos, essa interação é altamente específica, com um fundo baixo6. Como ambos os grupos são pequenos, as células não precisam se submeter à desnaturação de DNA para expor o análogo nucleosídeo, conforme necessário para o BrdU7. Finalmente, a química do clique é altamente versátil, e pode ser usada para a rotulagem metabólica de DNA, RNA, proteínas, ácidos graxos e carboidratos8,9,10,11. Se o alvo metabolicamente rotulado de interesse está na superfície celular, as células vivas podem ser rotulados12. Além disso, as células podem ser processadas para coloração imunofluorescente com anticorpos.
O seguinte protocolo descreve o uso da incorporação da UEd e clique na química para medir a proliferação de células musculares suaves vasculares humanas(Figura 1). Mostramos três maneiras diferentes de incorporação de EdU pode ser medido, resultados representativos de cada um, e suas vantagens e desvantagens. Medir a proliferação através da química do clique é particular útil para células de crescimento mais lentas e aderentes. Além disso, a morfologia da célula é bem conservada e a coloração baseada em anticorpos também pode ser realizada.
A incorporação da UEd é uma forma simples e direta de medir a proliferação celular; é particularmente útil para as células aderentes13. Nosso protocolo usa células musculares lisas, mas é aplicável a qualquer célula aderente (epiteliais, endoteliais, etc.). Embora o protocolo não seja complicado, o único passo crítico é fazer a solução de rotulagem – os ingredientes devem ser adicionados na ordem listada. Além disso, como as manchas ocidentais quimiiluminescentes, se usar a leit…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Katie Carroll por assistência técnica. Agradecemos também ao Dr. David Cool e ao Laboratório de Análise Proteômica por instruções e fornecimento do leitor de placas de imagem Cytation. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Wright State Foundation (para L.E.W.).
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
Cytation Plate Reader | Biotek | ||
EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
Synergy Plate Reader | Biotek | ||
THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |