Click Kimya kullanarak Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Çoğalmasını Ölçme
Summary
Proliferasyon hücresel fonksiyonun kritik bir parçasıdır ve yeni ilaçların potansiyel toksisitesini değerlendirmek için kullanılan yaygın bir okumadır. Bu nedenle, proliferasyonun ölçülmesi hücre biyolojisinde sıkça kullanılan bir ispondur. Burada, yapışık ve yapışık olmayan hücrelerde kullanılabilecek basit ve çok yönlü bir proliferasyon ölçme yöntemi salıyoruz.
Abstract
Bir hücrenin çoğalma yeteneği çoğu hücrenin normal fonksiyonunun ayrılmaz bir parçasıdır ve proliferasyon un disregülasyonu birçok hastalık süreçlerinin merkezinde yer alır. Bu nedenlerden dolayı, proliferasyonölçümü hücre fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan yaygın bir araçtır. Hücre çoğalması basitçe sayılarak ölçülebilir; ancak bu, çoğalma ölçmek için dolaylı bir araçtır. Bölmeye hazırlanan hücreleri doğrudan algılamanın ortak yollarından biri, etiketli nükleozit analoglarının birleştirilmesidir. Bunlar arasında radyoaktif nükleozit analog 3H-timinin artı 5-bromo-2′ deoksiürin (BrdU) ve 5-etirnil-2′-deoksitürin (EdU) gibi radyoaktif olmayan nükleozit analogları bulunmaktadır. EdU’nun dahil edilmesi, BrdU ile karşılaştırıldığında çeşitli avantajları olan tıklama kimyası ile algılanır. Bu raporda, EdU’nun dahil edilmesiyle çoğalma ölçmek için bir protokol salıyoruz. Bu protokol, her birinin avantajları ve dezavantajları ile birlikte çeşitli okumalar için seçenekler içerir. Ayrıca, protokolün planlanan deneyin özel gereksinimlerini karşılamak üzere optimize edilebildiği veya değiştirilebileceği yerleri de tartışırız. Son olarak, bu temel protokolün diğer hücre metabolitlerini ölçmek için değiştirilme yollarına değiniyoruz.
Introduction
Proliferasyon hücresel fonksiyonun kritik bir parçasıdır1,2. Proliferasyonun kontrolü, kanser ve kardiyovasküler hastalık gibi gelişim ve patolojik süreçler gibi normal süreçleri etkiler. Vasküler düz kas hücrelerinin hiperplastik büyüme, örneğin, ateroskleroz bir habercisi olduğu düşünülmektedir3. Hücre çoğalmasındaki değişiklikler, yeni ilaçların potansiyel toksisitesini değerlendirmek için de kullanılmaktadır. Yaygın etkisi göz önüne alındığında, proliferasyon ölçümü birçok hücre biyolojisi tabanlı laboratuvarların dayanak noktasıdır.
Hücre çoğalması, hücre popülasyonu oldukça hızlı bölünürse, sadece hücreleri sayarak ölçülebilir. Yavaş büyüyen hücreler için hücre sayıları daha az hassas olabilir. Proliferasyon genellikle etiketli nükleozit analoglarının birleştirilmesi ile ölçülür. Altın standart 3H-timidin dahil olmasına rağmen, birçok laboratuvarlar yeni, radyoaktif olmayan alternatifler durumu göz önüne alındığında bu yöntemden uzak laşıyorlar. Bunlar arasında sitoplazmik floresan boyalar, hücre döngüsü ile ilişkili proteinlerin saptanması ve 5-bromo-2′ deoksiürin (BrdU) ve 5-ethynyl-2′-deoksitürin(EdU) 4 gibi radyoaktif olmayan nükleozit analoglarının birleşmesi sayılabilir.
Karboksifluorescein diasetat succinimidyl ester (CFSE) gibi sitoplazmik boyalar, hücre5’iher bölünde de boyanın yoğunluğu yarıya indiği için çoğalma tespit eder. Bu teknik genellikle non-yapışık hücreler için akış sitometri kullanılır. Bu yapışık hücreler için çok kullanılmamıştır, ancak görüntüleme plaka okuyucuların yeni nesil ile bu değişebilir. Antikor temelli tekniklerle (akış sitometrisi, immünohistokimya, vb.) hücre döngüsü ile ilişkili proteinlerin saptanması genellikle dokular veya non-yapışık hücreler için kullanılır. Bu hücreler/dokular boyama dan önce sabit ve permeabilize edilmelidir. Nükleozit analogları BrdU ve EdU 3H-timidin yaklaşım benzer, ancak radyoaktivite rahatsızlık olmadan. BrdU’nun dahil edilmesi anti-BrdU antikorları tarafından saptanmıştır ve bu nedenle hücreler boyamadan önce sabit ve permeabilize edilmelidir. Buna ek olarak, brdU epitop maruz kalmak için hücreler DNase ile tedavi edilmelidir.
EdU’nun birleştirilmesi, alkin ve azid gruplarının katalitik bakır varlığında bir araya gelip “tıkladığı” tıklama kimyası ile saptanır. Her iki grup biyosentetik olarak dahil molekül veya algılamamolekülü 4olarak hizmet verebilir. Ticari olarak mevcut nükleozit analogları alkyne grubu bağlı. Bu nedenle, alkine fonksiyonel nükleozit analogunun floresan boya veya diğer belirteçlere konjuge bir azid ile saptanır. EdU’nun bã1/4tçeye karŠı çok sayıda avantajı bulunuyor. Birincisi, alkine ve azit grupları memeli hücrelerinde bulunmadığından, bu etkileşim düşük arka plan6ile son derece spesifiktir. Her iki grup da küçük olduğundan, brdU7için gerekli olan nükleozit analogunu ortaya çıkarmak için hücrelerin DNA denatürasyonuna geçmesi gerekmez. Son olarak, tıklama kimyası çok yönlü, ve DNA, RNA, protein, yağ asitleri vekarbonhidratlar8,9,10,11metabolik etiketleme için kullanılabilir. Metabolik olarak etiketlenmiş ilgi hedefi hücre yüzeyinde ise, canlı hücreler12olarak etiketlenebilir. Buna ek olarak, hücreler daha fazla antikorlar ile immünofloresan boyama için işlenebilir.
Aşağıdaki protokol, insan vasküler düz kas hücrelerinde çoğalmayı ölçmek için EdU kuruluş ve tıklama kimyası kullanımını açıklar(Şekil 1). EdU’nun üç farklı şekilde ölçülebileceğini, her birinden temsili sonuçlar ve bunların avantaj ve dezavantajlarının ölçülebileceğini gösteriyoruz. Tıklama kimyası ile çoğalma ölçme özellikle yapışık, yavaş büyüyen hücreler için yararlıdır. Buna ek olarak, hücrenin morfolojisi iyi korunur ve antikor bazlı boyama da yapılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
EdU’nun birleştirilmesi hücre çoğalmasını ölçmenin basit ve basit bir yoludur; özellikle yapışık hücreler için yararlıdır13. Protokolümüz düz kas hücreleri kullanır, ancak herhangi bir yapışık hücre için geçerlidir (epitel, endotel, vb). Protokol karmaşık olmasa da, tek kritik adım etiketleme çözümünü yapmaktır — maddeler listelenen sıraya eklenmelidir. Buna ek olarak, kemilüminesans Batı lekeleri gibi, lüminesans okuma kullanıyorsanız plaka hemen okunma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Katie Carroll’a teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr David Cool ve Proteomics Analiz Laboratuvarı öğretim ve Cytation görüntüleme plaka okuyucu sağlanması için teşekkür ederiz. Bu çalışma Wright Devlet Vakfı hibe (L.E.W.) tarafından desteklendi.
Materials
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
- Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
- Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
- Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
- Izquierdo, E., Delgado, A. Click chemistry in sphingolipid research. Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
- Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
- Stoddart, M. J. . Mammalian cell viability: methods and protocols. , (2011).
- Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
- Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
- Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
- Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).
