Mesurer la prolifération des cellules musculaires vasculaires lisses à l'aide de la chimie de clic
Summary
La prolifération est une partie essentielle de la fonction cellulaire, et une lecture commune utilisée pour évaluer la toxicité potentielle de nouveaux médicaments. La mesure de la prolifération est donc un résultat fréquemment utilisé en biologie cellulaire. Nous présentons ici une méthode simple et polyvalente de mesure de la prolifération qui peut être utilisée dans les cellules adhérentes et non adhérentes.
Abstract
La capacité d’une cellule à proliférer fait partie intégrante de la fonction normale de la plupart des cellules, et la dysrégulation de la prolifération est au cœur de nombreux processus de la maladie. Pour ces raisons, la mesure de la prolifération est un outil courant utilisé pour évaluer la fonction cellulaire. La prolifération cellulaire peut être mesurée simplement par comptage; cependant, il s’agit d’un moyen indirect de mesurer la prolifération. Un moyen courant de détecter directement les cellules se préparant à se diviser est par l’incorporation d’analogues nucléosides étiquetés. Il s’agit notamment de la nucléoside radioactive analogique 3H-thymidine plus non-radioactifs analogues nucléoside tels que 5-bromo-2′ deoxyuridine (BrdU) et 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU). L’incorporation d’EdU est détectée par la chimie de clic, qui a plusieurs avantages par rapport à BrdU. Dans ce rapport, nous fournissons un protocole pour mesurer la prolifération par l’incorporation de l’UE. Ce protocole comprend des options pour diverses lectures, ainsi que les avantages et les inconvénients de chacun. Nous discutons également des endroits où le protocole peut être optimisé ou modifié pour répondre aux besoins spécifiques de l’expérience planifiée. Enfin, nous touchons à la façon dont ce protocole de base peut être modifié pour mesurer d’autres métabolites cellulaires.
Introduction
La prolifération est une partie essentielle de la fonction cellulaire1,2. Le contrôle de la prolifération influence les processus normaux tels que le développement, et les processus pathologiques tels que le cancer et les maladies cardiovasculaires. La croissance hyperplastique des cellules musculaires lisses vasculaires, par exemple, est pensé pour être un précurseur de l’athérosclérose3. Les changements dans la prolifération cellulaire sont également utilisés pour évaluer la toxicité potentielle de nouveaux médicaments. Compte tenu de son impact généralisé, la mesure de la prolifération est un pilier de nombreux laboratoires de biologie cellulaire.
La prolifération cellulaire peut être mesurée en comptant simplement les cellules si la population cellulaire d’intérêt se divise assez rapidement. Pour les cellules à croissance plus lente, le nombre de cellules peut être moins sensible. La prolifération est souvent mesurée par l’incorporation d’analogues nucléodés étiquetés. Bien que l’étalon-or soit l’incorporation de 3H-thymidine, de nombreux laboratoires s’éloignent de cette méthode étant donné la disponibilité de nouvelles alternatives non radioactives. Il s’agit notamment de colorants fluorescents cytoplasmiques, la détection des protéines associées au cycle cellulaire, et l’incorporation d’analogues nucléosides non radioactifs tels que la désoxyuridine 5-bromo-2′ (BrdU) et 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU)4.
Les colorants cytoplasmiques, tels que la carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE), détectent la prolifération parce que l’intensité du colorant diminue à chaque fois que la cellule divise5. Cette technique est couramment utilisée dans la cytométrie de flux pour les cellules non adhérentes. Il n’a pas été utilisé beaucoup pour les cellules adhérentes, mais avec la nouvelle génération de lecteurs de plaques d’imagerie cela peut changer. La détection des protéines associées au cycle cellulaire par des techniques à base d’anticorps (cytométrie de flux, immunohistochimie, etc.) est souvent utilisée pour les tissus ou les cellules non adhérentes. Ces cellules/tissus doivent être fixés et perméabilisés avant la coloration. Les analogues nucléoside brdU et EdU sont similaires en approche à 3H-thymidine, mais sans les inconvénients de la radioactivité. L’incorporation de BrdU est détectée par des anticorps anti-BrdU, et donc les cellules doivent être fixées et perméabilisées avant la coloration. En outre, les cellules doivent être traitées avec DNase pour exposer l’épitope BrdU.
L’incorporation d’EdU est détectée par la chimie de clic, dans laquelle les groupes d’alkyne et d’azide « cliquent » ensemble en présence du cuivre catalytique. L’un ou l’autre groupe peut servir de molécule biosynthétiquement incorporée ou molécule de détection4. Les analogues nucléosidedisponibles disponibles dans le commerce ont le groupe d’alkyne attaché. Pour les essais de prolifération, par conséquent, l’analogue nucléoside fonctionnalisé d’alkyne est détecté par un azide conjugué à un colorant fluorescent ou à un autre marqueur. L’incorporation d’EdU présente plusieurs avantages par rapport à BrdU. Tout d’abord, parce que les groupes d’alkyne et d’azide ne se trouvent pas dans les cellules de mammifères, cette interaction est très spécifique avec un fond bas6. Parce que les deux groupes sont petits, les cellules n’ont pas besoin de subir la dénaturation de l’ADN pour exposer l’analogique nucléoside comme requis pour BrdU7. Enfin, la chimie de clic est très polyvalente, et peut être employée pour l’étiquetage métabolique de l’ADN, de l’ARN, des protéines, des acides gras, et des hydrates de carbone8,9,10,11. Si la cible d’intérêt étiquetée métaboliquement se trouve à la surface des cellules, les cellules vivantes peuvent être étiquetées12. En outre, les cellules peuvent être traitées plus en détail pour la coloration immunofluorescente avec des anticorps.
Le protocole suivant décrit l’utilisation de l’incorporation D’EdU et de la chimie des clics pour mesurer la prolifération dans les cellules musculaires lisses vasculaires humaines (Figure 1). Nous montrons trois façons différentes d’incorporation d’EdU peut être mesurée, les résultats représentatifs de chacun, et leurs avantages et inconvénients. La mesure de la prolifération par l’intermédiaire de la chimie de clic est particulièrement utile pour les cellules adhérentes et de plus en plus lentes. En outre, la morphologie de la cellule est bien entretenue et la coloration à base d’anticorps peut également être effectuée.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’incorporation d’EdU est un moyen simple et simple de mesurer la prolifération cellulaire; il est particulièrement utile pour les cellules adhérentes13. Notre protocole utilise des cellules musculaires lisses, mais il s’applique à toute cellule adhérente (épithéliale, endothéliale, etc.). Bien que le protocole ne soit pas compliqué, la seule étape critique consiste à faire la solution d’étiquetage — les ingrédients doivent être ajoutés dans l’ordre indiqué. En outre, comme les t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Katie Carroll pour son assistance technique. Nous remercions également le Dr David Cool et le Laboratoire d’analyse de la protéomique pour l’instruction et la fourniture du lecteur de plaques d’imagerie Cytation. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Wright State Foundation (à L.E.W.).
Materials
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
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