מדידת התפשטות של תאים שרירים וסקולריים חלקה באמצעות לחץ כימיה
Summary
התפשטות היא חלק מכריע בתפקוד הסלולר, ובדיקה משותפת המשמשת להערכת רעילות פוטנציאלית של תרופות חדשות. מדידת התפשטות היא, לכן, שימוש תכוף בביולוגיה התא. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה, רב-תכליתית של מדידת התפשטות כי ניתן להשתמש בתאים חסיד ושאינם חסיד.
Abstract
היכולת של תא להתרבות היא בלתי נפרד לתפקוד הרגיל של רוב התאים, והדיסרגולציה של התפשטות היא בלב תהליכי מחלות רבים. מסיבות אלה, מדידת ההפצה היא כלי נפוץ המשמש להערכת הפונקציה cell. ניתן למדוד את תפוצת התא רק על ידי ספירה; עם זאת, זהו אמצעי עקיף למדידת התפשטות. אחד האמצעים השכיחים של במישרין זיהוי תאים הכנת לחלק הוא על ידי התאגדות של התווית האנלוגית נוקלאוסייד. אלה כוללים את הרדיו האנלוגי נוקלאוטיל 3H-thymidine פלוס non-רדיואקטיבי נוקלאוסייד אנלוגיות כגון 5-bromo-2 ‘ Deoxyuridine (bromo) ו-5-ethynyl-2′-Deoxyuridine (EdU). התאגדות של EdU מזוהה על ידי לחיצה על כימיה, אשר יש מספר יתרונות כאשר בהשוואה BrdU. בדוח זה, אנו מספקים פרוטוקול למדידת התפשטות באמצעות התאגדות של EdU. פרוטוקול זה כולל אפשרויות לקריאות שונות, יחד עם היתרונות והחסרונות של כל אחד מהם. אנו גם דנים במקומות שבהם הפרוטוקול יכול להיות ממוטב או שונה כדי לענות על הצרכים הספציפיים של הניסוי המתוכנן. לבסוף, אנו נוגעים בדרכים כי פרוטוקול בסיסי זה ניתן לשנות עבור מדידת מטבוליטים תא אחרים.
Introduction
התפשטות היא חלק מכריע בתפקוד הסלולר1,2. שליטה על התפשטות ההשפעות על תהליכים נורמליים כגון פיתוח, תהליכים פתולוגיים כגון סרטן ומחלות לב וכלי דם. צמיחה היפרפלסטית של תאים שריר וסקולריים חלקה, למשל, הוא חשב להיות הקודמן טרשת עורקים3. שינויים בתפוצת התאים משמשים גם להערכת רעילות פוטנציאלית של תרופות חדשות. בהתחשב בהשפעה הנרחבת שלה, מדידת ההפצה היא התווך של מעבדות רבות בביולוגיה המבוססת על תאים.
ניתן למדוד את תפוצת התא על-ידי ספירת תאים בלבד אם אוכלוסיית הריבית מתפצלת במהירות רבה. עבור תאים הגדלים לאט יותר, ספירת תאים עשויה להיות פחות רגישה. התפשטות נמדדת לעתים קרובות על ידי התאגדות של התווית האנלוגית נוקלאוסייד. למרות התקן הזהב הוא 3H-thymidine התאגדות, מעבדות רבות מקבל הרחק משיטה זו בהתחשב בזמינות של חדש, לא רדיואקטיבי חלופות. אלה כוללים צבעי פלורסנט cytoplasmic, זיהוי של מחזור תאים חלבונים משויכים, והתאגדות של שאינם רדיואקטיביים נוקלאוסייד אנלוגיות כגון 5-bromo-2 ‘ deoxyuridine (Bromo) ו-5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)4.
צבעי cytoplasmic, כגון carboxyfluoraatstcdedit (CFSE), לזהות התפשטות משום שעוצמת החצאים של הצבע בכל פעם תא מחלק5. טכניקה זו משמשת בדרך כלל בזרימה cy, לנסות תאים שאינם חסיד. זה לא נעשה הרבה עבור תאים חסיד, אבל עם הדור החדש של הקוראים צלחת ההדמיה זה עשוי להשתנות. זיהוי של מחזור התא חלבונים הקשורים באמצעות נוגדנים מבוססי טכניקות (הזרימה cy, כימיה אימונוהיסטוכימיה, וכו ‘) משמש לעתים קרובות עבור רקמות או תאים שאינם חסיד. תאים/רקמות אלה חייב להיות קבוע מחלחל לפני כתמים. הפונקציה מזהה את הקוד האנלוגי מדומה BrdU ו-EdU דומים בגישה ל- 3שעות-thymidine. התאגדות של BrdU מזוהה על ידי נוגדנים אנטי BrdU, ולכן התאים חייב להיות קבוע וחדיר לפני כתמים. בנוסף, התאים חייבים להיות מטופלים עם DNase כדי לחשוף את האפיפי של BrdU.
התאגדות של EdU מזוהה על ידי לחיצה על כימיה, שבה הקבוצה האלקין והעזידה “לחץ” יחד בנוכחות של נחושת קטליטי. כל קבוצה יכולה לשמש כמולקולה הביואופטית המשולבת או מולקולה גילוי4. הקבוצה האלמני הזמינה מסחרית. לצורך התפשטות ההפצה, לפיכך, פונקציונליות האלנובית של נוקלאוסייד אנלוגי מזוהה על ידי עזידה מצומת לצבע פלורסנט או סמן אחר. לשילוב של EdU יש מספר יתרונות על BrdU. ראשית, מכיוון שקבוצות האלאלקין והעזידה אינן מצויים בתאי היונקים, האינטראקציה הזאת היא מאוד ספציפית עם רקע נמוך6. בגלל שתי הקבוצות הן קטנות, תאים לא צריך לעבור דנטורציה DNA כדי לחשוף את נוקלאוטיד אנלוגי כנדרש brdu7. לבסוף, לחץ על כימיה הוא תכליתי מאוד, והוא יכול לשמש תיוג מטבולית של DNA, RNA, חלבון, חומצות שומן, ופחמימות8,9,10,11. אם יעד הריבית הmetabolically נמצא על משטח התא, ניתן לתייג תאים חיים12. בנוסף, תאים יכולים להיות מעובדים עוד יותר עבור הוספת כתמים אימונולוורםעם נוגדנים.
הפרוטוקול הבא מתאר את השימוש ב-EdU התאגדות ולחץ כימיה כדי למדוד התפשטות בתאי השריר החלק כלי הדם האנושיים (איור 1). אנו מראים שלוש דרכים שונות של התאגדות של EdU ניתן למדוד, מייצגים תוצאות מכל אחד, ואת היתרונות והחסרונות שלהם. מדידת התפשטות באמצעות כימיה לחץ היא שימושית במיוחד עבור חסיד, תאים הגדלים לאט יותר. בנוסף, את המבנה של התא הוא מתוחזק היטב, מבוססי נוגדן מכתים ניתן גם לבצע.
Protocol
Representative Results
Discussion
התאגדות של EdU היא דרך פשוטה ופשוטה למדוד הפצת תאים; הוא שימושי במיוחד עבור תאים חסיד13. הפרוטוקול שלנו משתמש בתאי שריר חלקה, אבל זה חל על כל תא חסיד (אפיתל, אנדותל, וכו ‘). למרות שהפרוטוקול אינו מורכב, הצעד הקריטי היחיד מבצע את פתרון התיוג-יש להוסיף את החומרים בסדר המפורט. בנוסף, כמו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לקייטי קארול. על סיוע טכני אנו מודים גם ד ר דוד Cool ואת המעבדה לניתוח פרוטאומניקס להוראה על והאספקה של הקורא לוחית הדמיה של העיבוד. עבודה זו נתמכת על ידי המענק של קרן רייט סטייט (כדי L.E.W.).
Materials
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
- Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
- Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
- Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
- Izquierdo, E., Delgado, A. Click chemistry in sphingolipid research. Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
- Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
- Stoddart, M. J. . Mammalian cell viability: methods and protocols. , (2011).
- Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
- Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
- Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
- Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).
