Misurazione della proliferazione delle cellule muscolari lustiche vascolari utilizzando la chimica dei clic
Summary
La proliferazione è una parte fondamentale della funzione cellulare e una lettura comune utilizzata per valutare la potenziale tossicità di nuovi farmaci. Misurare la proliferazione è, quindi, un saggio frequentemente usato nella biologia cellulare. Qui presentiamo un metodo semplice e versatile di misurazione della proliferazione che può essere utilizzato in cellule aderenti e non aderenti.
Abstract
La capacità di una cellula di proliferare è parte integrante della normale funzione della maggior parte delle cellule, e la disregolazione della proliferazione è al centro di molti processi di malattia. Per questi motivi, la misurazione della proliferazione è uno strumento comune utilizzato per valutare la funzione cellulare. La proliferazione cellulare può essere misurata semplicemente contando; tuttavia, questo è un mezzo indiretto per misurare la proliferazione. Un mezzo comune per rilevare direttamente le cellule che si preparano a dividersi è l’incorporazione di analoghi nucleoside etichettati. Questi includono il nucleoside radioattivo analogico 3H-thymidine più analoghi nucleoside non radioattivi come la deossiuridina 5-bromo-2′ (BrdU) e 5-ethynyl-2-deoxyuridina (EdU). L’incorporazione di EdU è rilevata dalla chimica del click, che ha diversi vantaggi rispetto a BrdU. In questa relazione, forniamo un protocollo per misurare la proliferazione con l’incorporazione di EdU. Questo protocollo include opzioni per varie letture, insieme ai vantaggi e agli svantaggi di ciascuna. Discutiamo anche dei luoghi in cui il protocollo può essere ottimizzato o modificato per soddisfare le esigenze specifiche dell’esperimento pianificato. Infine, tocchiamo i modi in cui questo protocollo di base può essere modificato per misurare altri metaboliti cellulari.
Introduction
La proliferazione è una parte fondamentale della funzione cellulare1,2. Il controllo della proliferazione influenza i normali processi come lo sviluppo e i processi patologici come il cancro e le malattie cardiovascolari. La crescita iperplastica delle cellule muscolari lisce vascolari, per esempio, è pensata per essere un precursore dell’aterosclerosi3. I cambiamenti nella proliferazione cellulare sono utilizzati anche per valutare la potenziale tossicità di nuovi farmaci. Dato il suo impatto diffuso, la misurazione della proliferazione è un pilastro di molti laboratori basati sulla biologia cellulare.
La proliferazione cellulare può essere misurata semplicemente contando le cellule se la popolazione cellulare di interesse si divide abbastanza rapidamente. Per le cellule a crescita più lenta, i conteggi delle cellule possono essere meno sensibili. La proliferazione è spesso misurata dall’incorporazione di analoghi nucleoside etichettati. Anche se il gold standard è di 3H-tiofina, molti laboratori si stanno allontanando da questo metodo data la disponibilità di alternative più recenti e non radioattive. Questi includono coloranti fluorescenti citoplasmici, rilevamento di proteine associate al ciclo cellulare e incorporazione di analoghi nucleoside non radioattivi come la deossiuridina 5-bromo-2′ (BrdU) e 5-ethynyl-2-deoxyuridina (EdU)4.
I coloranti citoplasmici, come carboxyfluorescein diacetate succinimidil ester (CFSE), rilevano la proliferazione perché l’intensità del coloranti si dimezza ogni volta che la cellula si divide5. Questa tecnica è comunemente utilizzata nella citometria di flusso per le cellule non aderenti. Non è stato utilizzato molto per le cellule aderenti, ma con la nuova generazione di lettori di lastre di imaging questo può cambiare. La rilevazione delle proteine associate al ciclo cellulare attraverso tecniche basate su anticorpi (citometria di flusso, immunoistochimica, ecc.) è spesso utilizzata per tessuti o cellule non aderenti. Queste cellule/tessuti devono essere fissi e permeabilizzati prima della colorazione. Gli analoghi Nucleoside BrdU ed EdU sono simili nell’approccio a 3H-tiofina, ma senza l’inconveniente della radioattività. L’incorporazione di BrdU viene rilevata dagli anticorpi anti-BrdU, e quindi le cellule devono essere fisse e permeaabilizzate prima della colorazione. Inoltre, le cellule devono essere trattate con DNase per esporre l’epitopo BrdU.
L’incorporazione di EdU viene rilevata dalla chimica del click, in cui i gruppi alkyne e azide “click” insieme in presenza di rame catalitico. Entrambi i gruppi possono servire come molecola biosinteticamente incorporata o molecola di rilevamento4. Gli analoghi nucleoside disponibili in commercio hanno il gruppo alchino attaccato. Per i test di proliferazione, quindi, l’analogo nucleoside funzionalizzato alkyne viene rilevato da un’azide coniugata a un colore fluorescente o a un altro marcatore. L’incorporazione di EdU ha diversi vantaggi rispetto a BrdU. In primo luogo, perché i gruppi di alchine e azide non si trovano nelle cellule dei mammiferi, questa interazione è altamente specifica con uno sfondo basso6. Poiché entrambi i gruppi sono piccoli, le cellule non hanno bisogno di sottoporsi alla denaturazione del DNA per esporre l’analogo nucleoside come richiesto per BrdU7. Infine, la chimica del clic è altamente versatile e può essere utilizzata per l’etichettatura metabolica di DNA, RNA, proteine, acidi grassi e carboidrati8,9,10,11. Se l’obiettivo metabolicamente etichettato di interesse è sulla superficie cellulare, le cellule vive possono essere etichettate12. Inoltre, le cellule possono essere ulteriormente elaborate per la colorazione immunofluorescente con anticorpi.
Il protocollo seguente descrive l’uso dell’incorporazione EdU e la chimica dei clic per misurare la proliferazione nelle cellule muscolari lussuriane vascolari umane (Figura 1). Mostriamo tre diversi modi in cui l’incorporazione di EdU può essere misurata, risultati rappresentativi da ciascuno, e i loro vantaggi e svantaggi. Misurare la proliferazione tramite la chimica dei clic è particolarmente utile per le cellule aderenti e a bassa crescita. Inoltre, la morfologia della cellula è ben mantenuta e può anche essere eseguita una colorazione basata su anticorpi.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’incorporazione di EdU è un modo semplice e diretto per misurare la proliferazione cellulare; è particolarmente utile per le cellule aderenti13. Il nostro protocollo utilizza cellule muscolari lisce, ma è applicabile a qualsiasi cellula aderente (epiteliale, endoteliale, ecc.). Anche se il protocollo non è complicato, l’unico passo critico è fare la soluzione di etichettatura – gli ingredienti devono essere aggiunti nell’ordine elencato. Inoltre, come le macchie occidentali chemiluminescenti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Katie Carroll per l’assistenza tecnica. Ringraziamo anche il Dr. David Cool e il Laboratorio di Analisi Proteomics per l’istruzione e la fornitura del lettore di lastre di imaging Cytation. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Wright State Foundation (a L.E.W.).
Materials
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
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