क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के प्रसार को मापने
Summary
प्रसार सेलुलर समारोह का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, और एक आम readout नई दवाओं की संभावित विषाक्तता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया. मापने प्रसार है, इसलिए, सेल जीव विज्ञान में एक बार इस्तेमाल किया परख. यहाँ हम प्रसार है कि अनुयायी और गैर-अनुकूल कोशिकाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है को मापने के लिए एक सरल, बहुमुखी विधि पेश करते हैं.
Abstract
एक सेल की क्षमता को आगे बढ़ने के लिए सबसे कोशिकाओं के सामान्य समारोह का अभिन्न अंग है, और प्रसार के disविनियमन कई रोग प्रक्रियाओं के दिल में है. इन कारणों के लिए, प्रसार को मापने एक आम उपकरण सेल समारोह का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सेल प्रसार बस गिनती से मापा जा सकता है; हालांकि, यह प्रसार को मापने का एक अप्रत्यक्ष साधन है। सीधे विभाजित करने की तैयारी कोशिकाओं का पता लगाने का एक आम साधन लेबल न्यूक्लिओसाइड एनालॉग का समावेश द्वारा है. इनमें रेडियोधर्मी न्यूक्लिओसाइड एनालॉग 3एच-थाइमिडीन प्लस गैर-रेडियोएक्टिव न्यूक्लिओसाइड एनालॉग जैसे 5-ब्रोमो-2′ डिऑक्सीयूरिडीन (ब्रडू) और 5-एथयिनिल-2-डेऑक्सीयूरिन (ईयू) शामिल हैं। EdU का समावेश क्लिक रसायन विज्ञान, जो कई फायदे हैं जब BrdU की तुलना में द्वारा पता चला है. इस रिपोर्ट में, हम EdU के समावेश द्वारा प्रसार को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इस प्रोटोकॉल विभिन्न readouts के लिए विकल्प भी शामिल है, लाभ और प्रत्येक के नुकसान के साथ. हम उन स्थानों पर भी चर्चा करते हैं जहां प्रोटोकॉल को नियोजित प्रयोग की विशिष्ट आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए ऑप्टिमाइज़ किया जा सकता है या परिवर्तित किया जा सकता है. अंत में, हम तरीके है कि इस बुनियादी प्रोटोकॉल अन्य सेल चयापचयों को मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है पर स्पर्श.
Introduction
प्रसार सेल्यूलर प्रकार्य1,2का एक महत्वपूर्ण भाग है . प्रसार का नियंत्रण सामान्य प्रक्रियाओं जैसे विकास, और कैंसर और हृदय रोग जैसी रोगसंबंधी प्रक्रियाओं को प्रभावित करता है। संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के Hyperplastic विकास, उदाहरण के लिए, atherosclerosis3के लिए एक अग्रदूत माना जाता है. सेल प्रसार में परिवर्तन भी नई दवाओं की संभावित विषाक्तता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है. इसके व्यापक प्रभाव को देखते हुए, प्रसार को मापने के कई सेल जीव विज्ञान आधारित प्रयोगशालाओं का एक मुख्य आधार है.
सेल प्रसार बस कोशिकाओं की गिनती से मापा जा सकता है अगर ब्याज की कोशिका आबादी काफी तेजी से विभाजित करता है. धीमी बढ़ती कोशिकाओं के लिए, सेल गिनती कम संवेदनशील हो सकता है. प्रसार अक्सर लेबल न्यूक्लिओसाइड एनालॉग के समावेश द्वारा मापा जाता है। हालांकि सोने के मानक है 3एच थाइमिडीन निगमन, कई प्रयोगशालाओं नए, गैर रेडियोएक्टिव विकल्प की उपलब्धता को देखते हुए इस विधि से दूर हो रही है. इनमें साइटोप्लाज्मिक फ्लोरोसेंट रंग, सेल चक्र से जुड़े प्रोटीन का पता लगाना, और गैर-रेडियोसक्रिय न्यूक्लिओसाइड एनालॉग्स जैसे 5-ब्रोमो-2′ डिऑक्सीयूरिडीन (ब्रडू) और 5-एथोनिल-2-डियूरिऑक्सीडीन (ईयू)4शामिल हैं।
साइटोप्लाज्मिक रंग, जैसे कार्बोक्सीफ्लूओरेसिन डाइऐसीटेट सक्सिनिमिडिल एस्टर (सीएफएसई), प्रसार का पता लगाते हैं क्योंकि हर बार कोशिका विभाजित होने पर डाई की तीव्रता5हो जाती है। इस तकनीक का उपयोग आमतौर पर गैर-अनुकूल कोशिकाओं के लिए प्रवाह साइटोमेट्री में किया जाता है। यह अनुयायी कोशिकाओं के लिए ज्यादा इस्तेमाल नहीं किया गया है, लेकिन इमेजिंग प्लेट पाठकों की नई पीढ़ी के साथ यह बदल सकता है. एंटीबॉडी आधारित तकनीकों (प्रवाह साइटोमेट्री, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, आदि) के माध्यम से जुड़े सेल चक्र से जुड़े प्रोटीन का पता लगाना अक्सर ऊतकों या गैर-अनुकूल कोशिकाओं के लिए प्रयोग किया जाता है। इन कोशिकाओं/ऊतकों को स्थिर किया जाना चाहिए और धुंधला करने से पहले permebilized किया जाना चाहिए। न्यूक्लिओसाइड एनालॉग BrdU और EdU के दृष्टिकोण में समान हैं 3एच-थाइमिडीन, लेकिन रेडियोधर्मिता की असुविधा के बिना. BrdU का समावेश विरोधी BrdU एंटीबॉडी द्वारा पता चला है, और इसलिए कोशिकाओं को तय किया जाना चाहिए और धुंधला करने से पहले permebilized. इसके अलावा, कोशिकाओं DNase के साथ इलाज किया जाना चाहिए BrdU epitope बेनकाब करने के लिए.
EdU का समावेश क्लिक रसायन विज्ञान, जिसमें alkyne और azide समूहों “क्लिक करें” उत्प्रेरक तांबे की उपस्थिति में एक साथ द्वारा पता चला है. या तो समूह जैव संश्लेषित रूप से निगमित अणु या संसूचन अणु4के रूप में कार्य कर सकता है . वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध न्यूक्लिओसाइड एनालॉग में ऐल्किन समूह जुड़ा हुआ है। प्रसार परख के लिए, इसलिए, alkyne functionalized न्यूक्लिओसाइड अनुरूप एक फ्लोरोसेंट डाई या अन्य मार्कर के लिए संयुग्मी एक azide द्वारा पता चला है. EdU के शामिल BrdU पर कई फायदे हैं. सबसे पहले, क्योंकि alkyne और azide समूहों स्तनधारी कोशिकाओं में नहीं पाए जाते हैं, इस बातचीत के एक कम पृष्ठभूमि6के साथ अत्यधिक विशिष्ट है. क्योंकि दोनों समूह छोटे हैं, कोशिकाओं को डीएनए विकृतीकरण से गुजरना करने की जरूरत नहीं है के रूप में BrdU7के लिए आवश्यक न्यूक्लिओसाइड अनुरूप बेनकाब. अंत में, क्लिक रसायन अत्यधिक बहुमुखी है, और डीएनए, आरएनए, प्रोटीन, फैटी एसिड, और कार्बोहाइड्रेट8,9,10,11की चयापचय लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यदि उपापचयी रूप से ब्याज का लक्ष्य कोशिका सतह पर है, तो जीवित कोशिकाओं को12लेबल किया जा सकता है। इसके अलावा, कोशिकाओं को एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला के लिए आगे संसाधित किया जा सकता है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल EdU निगमन के उपयोग का वर्णन करता है और मानव संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में प्रसार को मापने के लिए रसायन विज्ञान पर क्लिक करें (चित्र 1)। हम EdU के शामिल तीन अलग अलग तरीके दिखाने के लिए मापा जा सकता है, प्रत्येक से प्रतिनिधि परिणाम, और उनके फायदे और नुकसान. क्लिक रसायन विज्ञान के माध्यम से प्रसार को मापने के अनुयायी, धीमी बढ़ती कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. इसके अलावा, सेल की आकृति विज्ञान अच्छी तरह से बनाए रखा है और एंटीबॉडी आधारित धुंधला भी किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
EdU का समावेश सेल प्रसार को मापने के लिए एक सरल, सीधा तरीका है; यह विशेष रूप से अनुशील कोशिकाओं13के लिए उपयोगी है. हमारे प्रोटोकॉल चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं का उपयोग करता है, लेकिन यह किसी भी अन…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए केटी कैरोल धन्यवाद. हम भी पर निर्देश और Cytation इमेजिंग प्लेट रीडर के प्रावधान के लिए डॉ डेविड कूल और Proteomics विश्लेषण प्रयोगशाला धन्यवाद. यह काम एक राइट स्टेट फाउंडेशन अनुदान (L.E.W. करने के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
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