قياس دورة الخلية محددة من γH2AX والمبرمج بعد الإجهاد السامة الجينية عن طريق قياس التدفق الخلوي
Summary
وتجمع الطريقة المعروضة بين التحليل الكمي لفواصل الحمض النووي المزدوج حبلا (DSBs)، وتوزيع دورة الخلية والمبرمج لتمكين تقييم دورة الخلية الخاصة للحث DSB وإصلاح، فضلا عن عواقب فشل الإصلاح.
Abstract
وقد وضعت طريقة المقدمة أو الإصدارات المعدلة قليلا لدراسة استجابات العلاج محددة والآثار الجانبية لمختلف العلاجات المضادة للسرطان كما تستخدم في الأورام السريرية. وهو يتيح إجراء تحليل كمي وطولي للاستجابة لأضرار الحمض النووي بعد الإجهاد السمية الجينية، كما يسببها العلاج الإشعاعي والعديد من الأدوية المضادة للسرطان. وتغطي هذه الطريقة جميع مراحل الاستجابة للتلف الحمض النووي، وتوفير نقاط النهاية للحث وإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوج حبلا (DSBs)، واعتقال دورة الخلية وموت الخلايا عن طريق المبرمج في حالة فشل الإصلاح. الجمع بين هذه القياسات يوفر معلومات عن آثار العلاج تعتمد على دورة الخلية، وبالتالي يسمح دراسة متعمقة للتفاعل بين الانتشار الخلوي وآليات المواجهة ضد تلف الحمض النووي. وبما أن تأثير العديد من علاجات السرطان بما في ذلك العوامل العلاجية الكيميائية والإشعاع المؤين يقتصر على مراحل دورة الخلايا المحددة أو يختلف بها بشدة، فإن التحليلات المترابطة تعتمد على طريقة قوية ومجدية لتقييم آثار العلاج على الحمض النووي بطريقة محددة دورة الخلية. هذا غير ممكن مع الاختبارات نقطة نهاية واحدة وميزة هامة من الأسلوب المقدم. لا تقتصر هذه الطريقة على أي خط خلية معين وقد تم اختبارها بدقة في العديد من خطوط الخلايا الورم ية وطبيعية الأنسجة. ويمكن تطبيقه على نطاق واسع كاختبار شامل للسمية الجينية في العديد من مجالات الأورام إلى جانب الأورام الإشعاعية، بما في ذلك تقييم عامل الخطر البيئي، وفحص الأدوية وتقييم عدم الاستقرار الوراثي في الخلايا السرطانية.
Introduction
الهدف من الأورام هو قتل أو تعطيل الخلايا السرطانية دون الإضرار بالخلايا الطبيعية. العديد من العلاجات إما بشكل مباشر أو غير مباشر الحث على الإجهاد السمية الجينية في الخلايا السرطانية، ولكن أيضا إلى بعض تمتد في الخلايا الطبيعية. وغالبا ما يتم الجمع بين العلاج الكيميائي أو الأدوية المستهدفة معالعلاج الإشعاعي لتعزيز حساسية الإشعاع للورم المشع 1،2،3،4،5،مما يسمح للحد من الجرعة الإشعاعية لتقليل تلف الأنسجة الطبيعية.
ويسبب الإشعاع المؤين وغيره من العوامل السامة جينيا أنواعا مختلفة من تلف الحمض النووي، بما في ذلك التعديلات الأساسية، ووصلات حبلا متقاطعة، وفواصل أحادية أو مزدوجة. فواصل الحمض النووي حبلا مزدوجة (DSBs) هي آفات الحمض النووي الأكثر خطورة وتحريضها هو المفتاح لتأثير قتل الخلية من الإشعاع المؤين ومختلف الأدوية الخلوية في العلاج الكيميائي الإشعاعي. DSBs لا تضر فقط سلامة الجينوم، ولكن أيضا تعزيز تشكيل الطفرات6،7. لذلك، تطورت مسارات إصلاح DSB مختلفة، وآليات للقضاء على الخلايا التالفة التي لا يمكن إصلاحها مثل المبرمج خلال التطور. يتم تنظيم الاستجابة الكاملة للتلف الحمض النووي (DDR) من قبل شبكة معقدة من مسارات الإشارات التي تصل من التعرف على تلف الحمض النووي والقبض على دورة الخلية للسماح لإصلاح الحمض النووي، إلى موت الخلايا المبرمجة أو التعطيل في حالة فشل الإصلاح8.
وقد تم تطوير طريقة قياس التدفق المقدمة للتحقيق في نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج بعد الإجهاد السمية الجينية في فحص شامل واحد يغطي الحث وإصلاح DSB، فضلا عن عواقب فشل الإصلاح. فهو يجمع بين قياس علامة DSB تطبيقها على نطاق واسع γH2AX مع تحليل دورة الخلية وتحريض المبرمج، وذلك باستخدام التحليل subG1 الكلاسيكية وتقييم أكثر تحديدا من تنشيط caspase-3.
الجمع بين هذه النقاط النهائية في فحص واحد ليس فقط يقلل من الوقت والعمالة ونفقات التكلفة، ولكن أيضا تمكن قياس دورة محددة الخلية من الحث DSB وإصلاح، فضلا عن تنشيط caspase-3. ولن تكون هذه التحليلات ممكنة من خلال الاختبارات التي أجريت بشكل مستقل، ولكنها ذات صلة وثيقة بالفهم الشامل للاستجابة لأضرار الحمض النووي بعد الإجهاد السمية الجينية. العديد من الأدوية المضادة للسرطان، مثل المركبات الخلوية، موجهة ضد انقسام الخلايا وكفاءتها تعتمد بشدة على مرحلة دورة الخلية. كما يعتمد توافر عمليات إصلاح DSB المختلفة على مرحلة دورة الخلية واختيار المسار وهو أمر بالغ الأهمية لدقة الإصلاح، وبدوره يحدد مصير الخلية9،10،11، 12. وبالإضافة إلى ذلك، فإن قياس مستويات DSB الخاص بدورة الخلايا أكثر دقة من التحليل المجمع، لأن مستويات DSB لا تعتمد فقط على جرعة مركب أو إشعاع سام جينياً، بل تعتمد أيضاً على محتوى الحمض النووي للخلية.
وقد استخدمت هذه الطريقة لمقارنة فعالية العلاجات الإشعاعية المختلفة للتغلب على آليات المقاومة في الورم الأرومي الدبقي13 وتشريح التفاعل بين الإشعاع المؤين والأدوية المستهدفة في الساركوما العظمية14،15 وسرطان الرعبدات غير النمطية التيرتويد16. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام الطريقة الموصوفة على نطاق واسع لتحليل الآثار الجانبية للراديو والعلاج الكيميائي على الخلايا الجذعية mesenchymal17،18،19،20،21، 22،23،24، والتي هي ضرورية لإصلاح تلف الأنسجة الطبيعية الناجمة عن العلاج ولها تطبيق محتمل في الطب التجديدي.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة مميزة سهلة الاستخدام، ويقدم قياس سريع ودقيق واستنساخ استجابة الضرر الحمض النووي بما في ذلك كسر حبلا مزدوجة (DSB) التعريفي وإصلاح، وآثار دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج. ويوفر الجمع بين نقاط النهاية هذه صورة أكمل لعلاقاتها المتبادلة من الاختبارات الفردية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر فريق مرفق قياس التدفق في المركز الألماني لبحوث السرطان (DKFZ) على دعمهم.
Materials
| 1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
- Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
- Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
- Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
- Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
- Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
- Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
- Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
- Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
- Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
- Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
- Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
- Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
- Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
- Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
- Meyer, B., Voss, K. -. O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
- Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
- Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
- Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
- Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
- Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
- Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
- Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).
