ΓH2AX ve Apoptosis'in Genotoksik Stres sonrası Akış Sitometrisi ile Hücre Döngüsüne Özgü Ölçümü
Summary
Sunulan yöntem DNA çift iplikçiks breaks (DSBs), hücre döngüsü dağılımı ve apoptosis kantitatif analizi birleştirerek DSB indüksiyon ve onarım hücre döngüsü özgü değerlendirilmesi yanı sıra onarım başarısızlık sonuçları sağlar.
Abstract
Sunulan yöntem veya biraz değiştirilmiş versiyonları klinik onkolojide kullanılan çeşitli anti-kanser tedavilerinin spesifik tedavi yanıtlarını ve yan etkilerini incelemek için geliştirilmiştir. Radyoterapi ve çok sayıda anti-kanser ilacının indüklediği gibi, genotoksik stres sonrası DNA hasar yanıtının kantitatif ve uzunlamasına analizini sağlar. Yöntem DNA hasar tepkisinin tüm aşamalarını kapsamaktadır, dna çift iplikçikli sonları (DSBs), hücre döngüsü durması ve onarım apoptosis ile hücre ölümü için uç noktaları sağlar. Bu ölçümlerin birleştirilmesi hücre döngüsüne bağlı tedavi etkileri hakkında bilgi sağlar ve böylece hücresel proliferasyon ve DNA hasarına karşı başa çıkma mekanizmaları arasındaki etkileşimin derinlemesine incelenmesini sağlar. Kemoterapötik ajanlar ve iyonlaştırıcı radyasyon da dahil olmak üzere birçok kanser terapötik etkisi sınırlı dır veya güçlü belirli hücre döngüsü aşamalarına göre değişir, korelasyon analizleri tedavi etkilerini değerlendirmek için sağlam ve uygulanabilir bir yöntem güveniyor hücre döngüsüne özgü bir şekilde DNA üzerinde. Bu tek uç nokta lı denemeler ve sunulan yöntemin önemli bir avantajı ile mümkün değildir. Yöntem herhangi bir hücre hattı ile sınırlı değildir ve iyice tümör ve normal doku hücre hatları çok sayıda test edilmiştir. Çevresel risk faktörü değerlendirmesi, ilaç taraması ve tümör hücrelerindeki genetik istikrarsızlığın değerlendirilmesi de dahil olmak üzere radyo-onkolojinin yanı sıra onkolojinin birçok alanında kapsamlı bir genotoksisite teşbesi olarak yaygın olarak uygulanabilir.
Introduction
Onkolojinin amacı normal hücrelere zarar vermeden kanser hücrelerini öldürmek veya inaktive etmektir. Birçok tedaviler ya doğrudan ya da dolaylı olarak kanser hücrelerinde genotoksik stres neden, ama aynı zamanda bazı normal hücrelerde genişletmek. Kemoterapi veya hedefli ilaçlar genellikle radyasyonlu tümör 1 radyosensitivite artırmak için radyoterapi ile birleştirilir1,2,3,4,5, hangi bir azalma sağlar normal doku hasarı en aza indirmek için radyasyon dozu.
Iyonlaştırıcı radyasyon ve diğer genotoksik ajanlar, baz modifikasyonları, iplikçik çapraz bağlantıları ve tek veya çift iplikçikli kırılmalar da dahil olmak üzere farklı türde DNA hasarına neden olur. DNA çift iplikçiksi sonları (DSB’ ler) en ciddi DNA lezyonlarıdır ve indüksiyonları radyokemoterapide iyonlaştırıcı radyasyon ve çeşitli sitostatik ilaçların hücre öldürücü etkisinin anahtarıdır. DSB’ler sadece genomun bütünlüğüne zarar vermekle kalmıyor, aynızamanda mutasyonların oluşumunu teşvik 6,7. Bu nedenle, farklı DSB onarım yolları, ve mekanizmalar apoptoz gibi onarılamaz hasarlı hücreleri ortadan kaldırmak için evrim sırasında geliştirilmiştir. Tüm DNA hasar yanıtı (DDR) DNA hasarı tanıma ve hücre döngüsü tutuklama DNA onarımı için izin vermek için ulaşmak sinyal yolları karmaşık bir ağ tarafından düzenlenir, programlanmış hücre ölümü veya inaktivasyon onarım başarısızlık durumunda8.
Sunulan akış sitometrik yöntemi, DSB indüksiyon ve onarımının yanı sıra onarım arızalarının sonuçlarını kapsayan kapsamlı bir analizde genotoksik stresten sonra DDR’yi araştırmak için geliştirilmiştir. Yaygın olarak uygulanan DSB marker γH2AX’ın ölçümü ile hücre döngüsünün analizi ve apoptozin indüksiyonu, klasik subG1 analizi ve caspase-3 aktivasyonunun daha spesifik değerlendirilmesi ile birleştirir.
Bu uç noktaların tek bir teşrindeki birleşimi sadece zaman, işçilik ve maliyet giderlerini azaltmaz, aynı zamanda hücre döngüsüne özgü DSB indüksiyon ve onarım ölçümünün yanı sıra caspase-3 aktivasyonunu da sağlar. Bu tür analizler bağımsız olarak yapılan tahlillerle mümkün değildir, ancak genotoksik stres sonrası DNA hasar yanıtının kapsamlı bir şekilde anlaşılması için son derece önemlidir. Birçok anti-kanser ilaçları, sitostatik bileşikler gibi, hücreleri bölen karşı yönlendirilir ve verimlilik güçlü hücre döngüsü aşamasına bağlıdır. Farklı DSB onarım süreçlerinin durumu da hücre döngüsü aşaması ve onarım doğruluğu için kritik olan yol seçimi bağlıdır ve sırayla hücre nin kaderini belirler9,10,11, 12. Yıl. Buna ek olarak, DSB düzeylerinin hücre döngüsüne özgü ölçümü havuzlu analizden daha doğrudur, çünkü DSB düzeyleri sadece bir genotoksik bileşiğin veya radyasyonun dozuna değil, aynı zamanda hücrenin DNA içeriğine de bağlıdır.
Bu yöntem glioblastoma13 direnç mekanizmaları aşmak için farklı radyoterapilerin etkinliğini karşılaştırmak ve osteosarkom 14,15 iyonlaştırıcı radyasyon ve hedefli ilaçlar arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılmıştır ve atipik teratoid rabdoid kanserler16. Ayrıca, açıklanan yöntem yaygın olarak mezenkimal kök hücreler üzerinde radyo ve kemoterapi yan etkilerini analiz etmek için kullanılmıştır17,18,19,20,21, 22,23,24, tedavikaynaklı normal doku hasarının onarımı için gerekli olan ve rejeneratif tıpta potansiyel bir uygulama var.
Protocol
Representative Results
Discussion
Özellikli yöntem kullanımı kolaydır ve çift iplikçik break (DSB) indüksiyon ve onarım, hücre döngüsü etkileri ve apoptotik hücre ölümü de dahil olmak üzere DNA hasar yanıtı hızlı, doğru ve tekrarlanabilir ölçüm sunuyor. Bu uç noktaların birleşimi, bireysel tahlillerden daha fazla ilişki ortamı sağlar. Bu yöntem, radyasyon biyolojisi, tedavisi ve korunması alanlarında ve daha genel olarak onkolojide (örn. çevresel risk faktörü değerlendirmesi, ilaç taraması ve genetik değerlendir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alman Kanser Araştırma Merkezi’ndeki (DKFZ) Flow Sitometri Tesisi ekibine desteklerinden dolayı teşekkür ederiz.
Materials
| 1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
- Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
- Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
- Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
- Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
- Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
- Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
- Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
- Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
- Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
- Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
- Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
- Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
- Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
- Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
- Meyer, B., Voss, K. -. O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
- Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
- Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
- Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
- Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
- Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
- Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
- Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).
