Zellzyklusspezifische Messung von H2AX und Apoptose nach genotoxischem Stress durch Durchflusszytometrie
Summary
Die vorgestellte Methode kombiniert die quantitative Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Zellzyklusverteilung und Apoptose, um eine zellzyklusspezifische Auswertung der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Folgen eines Reparaturfehlers zu ermöglichen.
Abstract
Die vorgestellte Methode oder leicht modifizierte Versionen wurden entwickelt, um spezifische Behandlungsreaktionen und Nebenwirkungen verschiedener Anti-Krebs-Behandlungen zu untersuchen, wie sie in der klinischen Onkologie verwendet werden. Es ermöglicht eine quantitative und Längsschnittanalyse der DNA-Schadensreaktion nach genotoxischem Stress, wie durch Strahlentherapie und eine Vielzahl von Anti-Krebs-Medikamenten induziert. Die Methode deckt alle Stadien der Reaktion auf DNA-Schäden ab und bietet Endpunkte für die Induktion und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Zellzyklusstillstand und Zelltod durch Apoptose im Falle eines Reparaturfehlers. Die Kombination dieser Messungen liefert Informationen über zellzyklusabhängige Behandlungseffekte und ermöglicht somit eine eingehende Untersuchung des Zusammenspiels zwischen Zellproliferation und Bewältigungsmechanismen gegen DNA-Schäden. Da die Wirkung vieler Krebstherapeutika, einschließlich Chemotherapeutika und ionisierender Strahlung, auf bestimmte Zellzyklusphasen begrenzt ist oder stark variiert, basieren korrelative Analysen auf einer robusten und praktikablen Methode zur Bewertung der Behandlungseffekte. auf die DNA in einer zellzyklusspezifischen Weise. Dies ist bei Single-Endpunkt-Assays und einem wichtigen Vorteil der vorgestellten Methode nicht möglich. Die Methode ist nicht auf eine bestimmte Zelllinie beschränkt und wurde gründlich in einer Vielzahl von Tumor- und normalen Gewebezelllinien getestet. Es kann weithin als umfassender Genotoxizitätstest in vielen Bereichen der Onkologie neben der Radioonkologie angewendet werden, einschließlich der Bewertung von Umweltrisikofaktoren, dem Arzneimittelscreening und der Bewertung genetischer Instabilität in Tumorzellen.
Introduction
Das Ziel der Onkologie ist es, Krebszellen abzutöten oder zu inaktivieren, ohne normale Zellen zu schädigen. Viele Therapien induzieren direkt oder indirekt genotoxischen Stress in Krebszellen, aber auch zu einigen in normalen Zellen. Chemotherapie oder gezielte Medikamente werden oft mit Strahlentherapie kombiniert, um die Radiosensitivität des bestrahlten Tumors1,2,3,4,5zu verbessern, was eine die Strahlendosis, um normale Gewebeschäden zu minimieren.
Ionisierende Strahlung und andere genotoxische Mittel verursachen verschiedene Arten von DNA-Schäden, einschließlich Basismodifikationen, Strang-Querverbindungen und Ein- oder Zweistrangbrüche. DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) sind die schwerwiegendsten DNA-Läsionen und ihre Induktion ist der Schlüssel zur Zelltötungswirkung ionisierender Strahlung und verschiedener zytostatischer Medikamente in der Radiochemotherapie. DSBs schädigen nicht nur die Integrität des Genoms, sondern fördern auch die Bildung von Mutationen6,7. Daher haben sich während der Evolution verschiedene DSB-Reparaturpfade und Mechanismen zur Beseitigung irreparabel beschädigter Zellen wie Apoptose entwickelt. Die gesamte DNA-Schadensreaktion (DDR) wird durch ein komplexes Netzwerk von Signalwegen reguliert, die von der ERKENNUNG von DNA-Schäden und dem Zellzyklusstillstand reichen, um eine DNA-Reparatur, einen programmierten Zelltod oder eine Inaktivierung im Falle eines Reparaturfehlers zu ermöglichen8.
Die vorgestellte zytometrische Strömungsmethode wurde entwickelt, um die DDR nach genotoxischem Stress in einem umfassenden Test zu untersuchen, der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Folgen eines Reparaturfehlers abdeckt. Es kombiniert die Messung des weit verbreiteten DSB-Markers H2AX mit der Analyse des Zellzyklus und der Induktion der Apoptose, mit klassischer SubG1-Analyse und einer spezifischeren Auswertung der Caspase-3-Aktivierung.
Die Kombination dieser Endpunkte in einem Test reduziert nicht nur Zeit-, Arbeits- und Kostenaufwand, sondern ermöglicht auch die zellzyklusspezifische Messung der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Caspase-3-Aktivierung. Solche Analysen wären mit unabhängig durchgeführten Assays nicht möglich, aber sie sind für ein umfassendes Verständnis der REAKTION auf DNA-Schäden nach genotoxischem Stress von großer Bedeutung. Viele Krebsmedikamente, wie z. B. zytostatische Verbindungen, richten sich gegen die Zellteilung und ihre Effizienz ist stark vom Zellzyklusstadium abhängig. Die Verfügbarkeit verschiedener DSB-Reparaturprozesse hängt auch von der Zellzyklusstufe und der Fürdier-Genauigkeit entscheidenden Zellzyklusphase und -wegwahl ab und bestimmt wiederum das Schicksal der Zelle9,10,11, 12. Darüber hinaus ist die zellzyklusspezifische Messung des DSB-Spiegels genauer als die gepoolte Analyse, da die DSB-Spiegel nicht nur von der Dosis einer genotoxischen Verbindung oder Strahlung abhängen, sondern auch vom DNA-Gehalt der Zelle.
Die Methode wurde verwendet, um die Wirksamkeit verschiedener Radiotherapien zu vergleichen, um Resistenzmechanismen bei Glioblastom13 zu überwinden und das Zusammenspiel zwischen ionisierender Strahlung und gezielten Medikamenten bei Osteosarkom14,15 zu sezieren. und atypische teraide Rhabdoidkrebs16. Darüber hinaus wurde die beschriebene Methode weit verbreitet, um Nebenwirkungen von Radio- und Chemotherapie auf mesenchymale Stammzellen17,18,19,20,21, 22,23,24, die für die Reparatur von behandlungsbedingten normalen Gewebeschäden unerlässlich sind und eine mögliche Anwendung in der regenerativen Medizin haben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorgestellte Methode ist einfach zu bedienen und bietet eine schnelle, genaue und reproduzierbare Messung der DNA-Schadensreaktion einschließlich Doppelstrangbruch (DSB) Induktion und Reparatur, Zellzykluseffekte und apoptotischezellige Tod. Die Kombination dieser Endpunkte bietet ein vollständigeres Bild ihrer Zusammenhänge als einzelne Assays. Die Methode kann in den Bereichen Strahlenbiologie, Therapie und Schutz und ganz allgemein in der Onkologie (z. B. für die Bewertung von Umweltrisikofaktoren, Arzneimitte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Flow Cytometry Facility Team des Deutschen Krebsforschungszentrums (DKFZ) für die Unterstützung.
Materials
| 1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
- Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
- Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
- Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
- Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
- Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
- Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
- Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
- Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
- Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
- Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
- Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
- Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
- Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
- Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
- Meyer, B., Voss, K. -. O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
- Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
- Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
- Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
- Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
- Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
- Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
- Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).
