Medición específica del ciclo celular de la éH2AX y la apoptosis después del estrés genotóxico por citometría de flujo
Summary
El método presentado combina el análisis cuantitativo de las roturas de doble cadena de ADN (DSB), la distribución del ciclo celular y la apoptosis para permitir la evaluación específica del ciclo celular del Dsb de inducción y la reparación, así como las consecuencias de la falla de reparación.
Abstract
El método presentado o versiones ligeramente modificadas han sido ideados para estudiar las respuestas específicas del tratamiento y los efectos secundarios de varios tratamientos contra el cáncer como se utiliza en la oncología clínica. Permite un análisis cuantitativo y longitudinal de la respuesta del daño del ADN después del estrés genotóxico, inducido por la radioterapia y una multitud de fármacos contra el cáncer. El método cubre todas las etapas de la respuesta al daño del ADN, proporcionando puntos finales para la inducción y reparación de roturas de doble cadena de ADN (DSB), detención del ciclo celular y muerte celular por apoptosis en caso de falla de reparación. La combinación de estas mediciones proporciona información sobre los efectos del tratamiento dependientedel del ciclo celular y, por lo tanto, permite un estudio en profundidad de la interacción entre la proliferación celular y los mecanismos de afrontamiento contra el daño del ADN. Dado que el efecto de muchas terapias oncológicas, incluidos los agentes quimioterápicos y la radiación ionizante, varía o varía considerablemente según las fases específicas del ciclo celular, los análisis correlativos se basan en un método robusto y factible para evaluar los efectos del tratamiento en el ADN de una manera específica del ciclo celular. Esto no es posible con ensayos de un solo punto y una ventaja importante del método presentado. El método no se limita a ninguna línea celular en particular y se ha probado a fondo en una multitud de líneas celulares tumorales y de tejido normal. Se puede aplicar ampliamente como un ensayo integral de genotoxicidad en muchos campos de la oncología además de la radiooncología, incluida la evaluación de factores de riesgo ambientales, la detección de fármacos y la evaluación de la inestabilidad genética en las células tumorales.
Introduction
El objetivo de la oncología es matar o desactivar las células cancerosas sin dañar las células normales. Muchas terapias inducen directa o indirectamente estrés genotóxico en las células cancerosas, pero también a cierta extensión en las células normales. La quimioterapia o los medicamentos dirigidos a menudo se combinan con radioterapia para mejorar la radicalidad del tumor irradiado1,2,3,4,5, lo que permite una reducción de la dosis de radiación para minimizar el daño normal del tejido.
La radiación ionizante y otros agentes genotóxicos inducen diferentes tipos de daño en el ADN, incluidas modificaciones en la base, retituladores de hebras y roturas de una o dos hilos. Las roturas de doble cadena de ADN (DSB) son las lesiones de ADN más graves y su inducción es clave para el efecto mortal celular de la radiación ionizante y varios fármacos citostáticos en la radioterapia. Los DSB no sólo dañan la integridad del genoma, sino que también promueven la formación de mutaciones6,7. Por lo tanto, diferentes vías de reparación dsb, y mecanismos para eliminar las células irreparablemente dañadas como la apoptosis se han desarrollado durante la evolución. Toda la respuesta de daño al ADN (DDR) está regulada por una compleja red de vías de señalización que se extiendendesde el reconocimiento de daños del ADN y la detención del ciclo celular para permitir la reparación del ADN, hasta la muerte celular programada o la inactivación en caso de fallo de reparación 8.
El método citométrico de flujo presentado se ha desarrollado para investigar la DDR después de la tensión genotóxica en un ensayo exhaustivo que cubre la inducción y reparación del DSB, así como las consecuencias de la falla de reparación. Combina la medición del marcador DSB-H2AX ampliamente aplicado con el análisis del ciclo celular y la inducción de la apoptosis, utilizando el análisis subG1 clásico y la evaluación más específica de la activación de la caspasa-3.
La combinación de estos puntos finales en un ensayo no solo reduce los gastos de tiempo, mano de obra y costos, sino que también permite la medición específica del ciclo celular de la inducción y reparación del DSB, así como la activación de la caspasa-3. Estos análisis no serían posibles con ensayos realizados de forma independiente, pero son muy relevantes para una comprensión integral de la respuesta del daño del ADN después del estrés genotóxico. Muchos medicamentos contra el cáncer, como los compuestos citostáticos, se dirigen contra las células divisorias y su eficiencia depende en gran medida de la etapa del ciclo celular. La disponibilidad de diferentes procesos de reparación del Dsb también depende de la etapa del ciclo celular yde la elección de la vía, que es fundamental para la precisión de la reparación, y a su vez determina el destino de la celda 9,10,11, 12. Además, la medición específica del ciclo celular de los niveles de OSD es más precisa que el análisis agrupado, ya que los niveles de OSD no sólo dependen de la dosis de un compuesto genotóxico o radiación, sino también del contenido de ADN de la célula.
El método se ha utilizado para comparar la eficacia de diferentes radioterapias para superar los mecanismos de resistencia en el glioblastoma13 y para diseccionar la interacción entre la radiación ionizante y los fármacos dirigidos en el osteosarcoma14,15 y cánceres de rabdoide teratoide atípico16. Además, el método descrito se ha utilizado ampliamente para analizar los efectos secundarios de la radio y la quimioterapia en las células madre mesenquimales17,18,19,20,21, 22,23,24, que son esenciales para la reparación del daño tisular normal inducido por el tratamiento y tienen una posible aplicación en la medicina regenerativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método destacado es fácil de usar y ofrece una medición rápida, precisa y reproducible de la respuesta de daño del ADN, incluyendo la inducción y reparación de rotura de doble cadena (DSB), efectos del ciclo celular y muerte celular apoptótica. La combinación de estos puntos finales proporciona una imagen más completa de sus interrelaciones que los ensayos individuales. El método puede aplicarse ampliamente como un ensayo integral de genotoxicidad en los campos de la biología de la radiación, la terapia y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al equipo de Flow Cytometry Facility en el Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ) por su apoyo.
Materials
| 1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
- Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
- Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
- Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
- Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
- Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
- Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
- Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
- Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
- Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
- Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
- Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
- Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
- Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
- Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
- Meyer, B., Voss, K. -. O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
- Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
- Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
- Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
- Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
- Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
- Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
- Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).
