प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा जेनोटॉक्सिक तनाव के बाद सेल साइकिल-विशिष्ट मापन
Summary
प्रस्तुत विधि डीएनए डबल खिंचाव टूट जाता है (DSBs), सेल चक्र वितरण और apoptosis के मात्रात्मक विश्लेषण को जोड़ती है डीएसबी प्रेरण और मरम्मत के साथ ही मरम्मत की विफलता के परिणामों के सेल चक्र-विशिष्ट मूल्यांकन सक्षम करने के लिए.
Abstract
प्रस्तुत विधि या थोड़ा संशोधित संस्करण नैदानिक ऑन्कोलॉजी में इस्तेमाल के रूप में विशिष्ट उपचार प्रतिक्रियाओं और विभिन्न विरोधी कैंसर उपचार के साइड इफेक्ट का अध्ययन करने के लिए तैयार किया गया है। यह जीनोटॉक्सिक तनाव के बाद डीएनए क्षति प्रतिक्रिया का एक मात्रात्मक और अनुदैर्घ्य विश्लेषण सक्षम बनाता है, रेडियोथेरेपी और एंटी-कैंसर दवाओं की एक भीड़ द्वारा प्रेरित के रूप में। विधि डीएनए क्षति प्रतिक्रिया के सभी चरणों को शामिल किया गया, प्रेरण और डीएनए डबल खिंचाव टूट जाता है (DSBs), सेल चक्र गिरफ्तारी और मरम्मत की विफलता के मामले में apoptosis द्वारा सेल मौत की मरम्मत के लिए समापन बिंदु प्रदान करते हैं. इन माप के संयोजन सेल चक्र पर निर्भर उपचार प्रभाव के बारे में जानकारी प्रदान करता है और इस प्रकार सेलुलर प्रसार और डीएनए क्षति के खिलाफ मुकाबला तंत्र के बीच परस्पर क्रिया का एक में गहराई से अध्ययन की अनुमति देता है. के रूप में रसायन चिकित्सा एजेंटों और ionizing विकिरण सहित कई कैंसर चिकित्सा के प्रभाव तक सीमित है या दृढ़ता से विशिष्ट सेल चक्र चरणों के अनुसार बदलता है, सहसंबंधी विश्लेषण उपचार प्रभाव का आकलन करने के लिए एक मजबूत और व्यवहार्य विधि पर भरोसा करते हैं एक सेल चक्र विशेष तरीके से डीएनए पर. यह एकल समापन बिंदु assays और प्रस्तुत विधि का एक महत्वपूर्ण लाभ के साथ संभव नहीं है. विधि किसी विशेष सेल लाइन तक ही सीमित नहीं है और अच्छी तरह से ट्यूमर और सामान्य ऊतक सेल लाइनों की एक भीड़ में परीक्षण किया गया है. यह व्यापक रूप से पर्यावरण जोखिम कारक आकलन, दवा स्क्रीनिंग और ट्यूमर कोशिकाओं में आनुवंशिक अस्थिरता के मूल्यांकन सहित रेडियो-ऑन्कोलॉजी के अलावा ऑन्कोलॉजी के कई क्षेत्रों में एक व्यापक जीनोटॉक्सिसिटी परख के रूप में लागू किया जा सकता है।
Introduction
ऑन्कोलॉजी का लक्ष्य सामान्य कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाए बिना कैंसर कोशिकाओं को मारने या निष्क्रिय करना है। कई चिकित्सा या तो प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से कैंसर की कोशिकाओं में genotoxic तनाव प्रेरित, लेकिन यह भी कुछ सामान्य कोशिकाओं में विस्तार करने के लिए. रसायन चिकित्सा या लक्षित दवाओं अक्सर रेडियोथेरेपीके साथ संयुक्त विकिरणित ट्यूमर1,2,3,4,5, जो की कमी के लिए अनुमति देता है की रेडियो संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए कर रहे हैं विकिरण खुराक सामान्य ऊतक क्षति को कम करने के लिए।
Ionizing विकिरण और अन्य genotoxic एजेंटों आधार संशोधनों, किनारा crosslinks और एकल या डबल खिंचाव टूट जाता है सहित डीएनए क्षति के विभिन्न प्रकार, प्रेरित. डीएनए डबल खिंचाव टूट जाता है (DSBs) सबसे गंभीर डीएनए घाव ों रहे हैं और उनके प्रेरण रेडियोकेमोथेरेपी में ionizing विकिरण और विभिन्न cytostatic दवाओं के सेल हत्या प्रभाव के लिए महत्वपूर्ण है. डीएसबी न केवल जीनोम की अखंडता को नुकसान पहुंचाते हैं बल्कि उत्परिवर्तनों के गठन को भी बढ़ावा देते हैं6,7. इसलिए, विभिन्न डीएसबी मरम्मत रास्ते, और apoptosis की तरह अपूरणीय क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को खत्म करने के लिए तंत्र विकास के दौरान विकसित किया है. पूरे डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) डीएनए क्षति मान्यता और सेल चक्र गिरफ्तारी से संपर्क डीएनए क्षति की मरम्मत के लिए अनुमति देने के लिए, मरम्मत विफलता8के मामले में क्रमादेशित सेल मौत या निष्क्रियता के लिए, डीएनए क्षति मान्यता और सेल चक्र गिरफ्तारी से पहुँचने के संकेतन रास्ते के एक जटिल नेटवर्क द्वारा विनियमित है।
प्रस्तुत प्रवाह cytometric विधि एक व्यापक परख है कि डीएसबी प्रेरण और मरम्मत को शामिल किया गया है, साथ ही मरम्मत की विफलता के परिणामों में जीनोटॉक्सिक तनाव के बाद DDR की जांच करने के लिए विकसित किया गया है. यह सेल चक्र के विश्लेषण और apoptosis के प्रेरण के साथ व्यापक रूप से लागू डीएसबी मार्कर की माप को जोड़ती है, शास्त्रीय subG1 विश्लेषण और caspase-3 सक्रियण के अधिक विशिष्ट मूल्यांकन का उपयोग कर.
एक परख में इन समापन बिंदुओं के संयोजन न केवल समय, श्रम और लागत खर्च कम कर देता है, लेकिन यह भी डीएसबी प्रेरण और मरम्मत के सेल चक्र-विशिष्ट माप, साथ ही caspase-3 सक्रियण सक्षम बनाता है। इस तरह के विश्लेषण स्वतंत्र रूप से आयोजित परख के साथ संभव नहीं होगा, लेकिन वे जीनोटॉक्सिक तनाव के बाद डीएनए क्षति प्रतिक्रिया की एक व्यापक समझ के लिए अत्यधिक प्रासंगिक हैं. ऐसे cytostatic यौगिकों के रूप में कई विरोधी कैंसर दवाओं, विभाजन कोशिकाओं के खिलाफ निर्देशित कर रहे हैं और उनकी दक्षता दृढ़ता से सेल चक्र चरण पर निर्भर है. विभिन्न डीएसबी मरम्मत प्रक्रियाओं की उपलब्धता भी सेल चक्र चरण और मार्ग विकल्प है जो मरम्मत सटीकता के लिए महत्वपूर्ण है पर निर्भर है, और बदले में सेल9,10,11के भाग्य निर्धारित करता है, 12. इसके अलावा, डीएसबी के स्तर की सेल चक्र-विशिष्ट माप पूल्ड विश्लेषण की तुलना में अधिक सटीक है, क्योंकि डीएसबी का स्तर केवल एक जीनोटॉक्सिक यौगिक या विकिरण की खुराक पर निर्भर नहीं है, बल्कि सेल की डीएनए सामग्री पर भी निर्भर है।
विधि glioblastoma13 में प्रतिरोध तंत्र पर काबू पाने के लिए विभिन्न रेडियोथैरेपी की प्रभावकारिता की तुलना करने के लिए और osteosarcoma में ionizing विकिरण और लक्षित दवाओं के बीच परस्पर क्रिया को विभाजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है14,15 और अटूट teratoid raboid कैंसर16| इसके अतिरिक्त, वर्णित विधि व्यापक रूप से mesenchymal स्टेम कोशिकाओं पर रेडियो और रसायन चिकित्सा के दुष्प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है17,18,19,20,21, 22,23,24, जो उपचार प्रेरित सामान्य ऊतक क्षति की मरम्मत के लिए आवश्यक हैं और पुनर्योजी चिकित्सा में एक संभावित आवेदन किया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
विशेष रुप से प्रदर्शित विधि का उपयोग करने के लिए आसान है और डबल खिंचाव तोड़ (डीएसबी) प्रेरण और मरम्मत, सेल चक्र प्रभाव और apoptotic सेल मौत सहित डीएनए क्षति प्रतिक्रिया का एक तेज, सटीक और reproducible माप प्रदान करता ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनके समर्थन के लिए जर्मन कैंसर अनुसंधान केंद्र (DKF]) में फ्लो साइटोमेट्री सुविधा टीम धन्यवाद.
Materials
| 1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
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