Celle syklus-spesifikk måling av γH2AX og apoptose etter gentoksisk stress av Flow flowcytometri
Summary
Den presenterte metoden kombinerer den kvantitative analysen av DNA dobbel-strand pauser (DSBs), celle syklus distribusjon og apoptose for å muliggjøre celle syklus-spesifikk evaluering av DSB induksjon og reparasjon, samt konsekvensene av reparasjons svikt.
Abstract
Den presenterte metoden eller litt modifisert versjoner har blitt utviklet for å studere konkrete behandlingstiltak og bivirkninger av ulike anti-kreft behandlinger som brukes i klinisk onkologi. Det gjør det mulig for en kvantitativ og langsgående analyse av DNA-skaden respons etter gentoksisk stress, som indusert av strålebehandling og en rekke anti-kreft narkotika. Metoden dekker alle stadier av DNA-skaden respons, gir endepunkter for induksjon og reparasjon av DNA dobbel-strand pauser (DSBs), celle syklus arrest og celle død av apoptose i tilfelle reparasjon svikt. Kombinere disse målingene gir informasjon om celle syklus-avhengige behandlingseffekter og dermed gir en grundig studie av samspillet mellom cellulære spredning og mestring mekanismer mot DNA skade. Som effekten av mange kreftlegemidler, inkludert kjemoterapeutiske midler og ioniserende stråling er begrenset til eller sterkt varierer i henhold til spesifikke celle syklus faser, correlative analyser stole på en robust og gjennomførbar metode for å vurdere behandlingen effekter på DNA i en celle syklus-spesifikk måte. Dette er ikke mulig med enkelt endepunkt analyser og en viktig fordel med den presenterte metoden. Metoden er ikke begrenset til en bestemt cellelinje og har blitt grundig testet i en rekke tumor og normal vev cellelinjer. Det kan bli mye brukt som en omfattende gentoksisitet analysen i mange felt av onkologi foruten radio-onkologi, inkludert miljømessige risikofaktor vurdering, narkotika screening og evaluering av genetisk ustabilitet i tumorceller.
Introduction
Målet med onkologi er å drepe eller deaktivere kreftceller uten å skade normale celler. Mange terapier enten direkte eller indirekte induserer gentoksisk stress i kreftceller, men også til noen forlenge i normale celler. Kjemoterapi eller målrettede legemidler er ofte kombinert med strålebehandling for å forsterke radiosensitivity av bestrålt tumor1, 2,3,4,5, som gir mulighet for en reduksjon av strålingsdosen for å minimere normal vevsskade.
Ioniserende stråling og andre gentoksisk midler induserer ulike typer DNA skade, inkludert base modifikasjoner, strand krysskoblinger og Single-eller Double-strand pauser. DNA dobbel-strand pauser (DSBs) er de mest alvorlige DNA lesjoner og deres induksjon er nøkkelen til cellen drepe effekten av ioniserende stråling og ulike cytostatiske narkotika i radiochemotherapy. DSBs ikke bare skade integriteten til Genova, men også fremme dannelsen av mutasjoner6,7. Derfor forskjellige DSB reparasjon trasé, og mekanismer for å eliminere ugjenkallelig skadede celler som apoptose har utviklet seg i løpet av evolusjon. Hele DNA-skade respons (DDR) er regulert av et komplekst nettverk av signalering trasé som kommer fra DNA-skade anerkjennelse og celle syklus arrestert for å tillate for DNA-reparasjon, til programmert celle død eller inaktive i tilfelle reparasjon svikt8.
Den presenterte flyten analytiske metoden er utviklet for å undersøke DDR etter gentoksisk stress i en omfattende analysen som dekker DSB induksjon og reparasjon, samt konsekvenser av reparasjons feil. Den kombinerer måling av mye brukt DSB markør γH2AX med analyse av celle syklus og induksjon av apoptose, ved hjelp av klassisk subG1 analyse og mer spesifikk evaluering av ordtak-3 aktivering.
Kombinasjonen av disse endepunktene i en analyse reduserer ikke bare tid, arbeid og kostnads utgifter, men muliggjør også celle syklus spesifikk måling av DSB induksjon og reparasjon, samt ordtak-3-aktivering. Slike analyser vil ikke være mulig med uavhengig gjennomførte analyser, men de er svært relevante for en helhetlig forståelse av DNA-skaden respons etter gentoksisk stress. Mange anti-kreft narkotika, for eksempel cytostatiske forbindelser, er rettet mot å dele celler og deres effektivitet er sterkt avhengig av celle syklus scenen. Tilgjengeligheten av ulike DSB reparasjonsprosesser er også avhengig av celle syklus scenen og Pathway valg som er avgjørende for reparasjon nøyaktighet, og i sin tur bestemmer skjebnen til cellen9,10,11, det er 12. I tillegg er celle syklus-spesifikk måling av DSB nivåer mer nøyaktig enn samlet analyse, fordi DSB nivåer er ikke bare avhengig av dosen av en gentoksisk sammensatte eller stråling, men også på DNA-innholdet i cellen.
Metoden har blitt brukt til å sammenligne effekten av ulike radiotherapies for å overvinne motstands mekanismer i glioblastom13 og å analysere samspillet mellom ioniserende stråling og målrettede stoffer i osteosarcoma14,15 og atypisk teratoid rhabdoid kreft16. I tillegg har den beskrevne metoden blitt mye brukt til å analysere bivirkninger av radio-og kjemoterapi på Mesenchymal stamceller17,18,19,20,21, 22,23,24, som er avgjørende for reparasjon av behandling-indusert normal vevsskade og har en potensiell anvendelse i regenererende medisin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den inneholdt metoden er enkel å bruke og tilbyr en rask, nøyaktig og reproduserbar måling av DNA-skaden respons inkludert Double-strand Break (DSB) induksjon og reparasjon, celle syklus effekter og apoptotisk celle død. Kombinasjonen av disse endepunktene gir et mer fullstendig bilde av relasjonene deres enn individuelle analyser. Metoden kan bli mye brukt som en omfattende gentoksisitet analysen innen stråling biologi, terapi og beskyttelse, og mer generelt i onkologi (f. eks, for miljørisiko faktor vurdering, na…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Flow flowcytometri Facility-teamet ved det tyske kreft forskningssenteret (DKFZ) for deres støtte.
Materials
| 1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
References
- Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
- Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
- Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
- Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
- Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
- Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
- Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
- Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
- Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
- Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
- Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
- Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
- Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
- Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
- Meyer, B., Voss, K. -. O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
- Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
- Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
- Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
- Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
- Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
- Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
- Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).
