المناهج الكمية لدراسة الهياكل الخلوية ومورفولوجيا الأعضاء في الكنورهابدية
Summary
توضح هذه الدراسة القياسات الكمية لحجم متشابك والتعريب، ومورفولوجيا العضلات، وشكل الميتوكوندريا في C. elegans باستخدام أدوات معالجة الصور المتاحة بحرية. يسمح هذا النهج للدراسات المستقبلية في C. elegans بمقارنة كمية مدى التغيرات الهيكلية للأنسجة والأعضاء نتيجة للطفرات الوراثية.
Abstract
تحديد الآليات الخلوية الكامنة وراء المرض أمر ضروري لتطوير علاجات جديدة. وتتمثل الاستراتيجية التي كثيرا ما تستخدم لكشف هذه الآليات في إدخال طفرات في الجينات المرشحة ووصف التغيرات النوعية في مورفولوجيا الأنسجة والعضيات الخلوية. ومع ذلك، قد لا تلتقط الأوصاف النوعية اختلافات فينوتيبيك خفية، وقد تشوه الاختلافات الفينوتية عبر الأفراد في مجموعة سكانية، وكثيراً ما يتم تقييمها ذاتياً. هنا، يتم وصف النهج الكمية لدراسة مورفولوجيا الأنسجة والعضيات في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans باستخدام المسح الضوئي بالليزر المجهرية البؤرية جنبا إلى جنب مع برامج معالجة الصور الحيوية المتاحة تجاريا. تم إجراء تحليل كمي للأنماط الظاهرية التي تؤثر على سلامة المشبك (الحجم ومستويات الفلورة المتكاملة)، وتنمية العضلات (حجم خلية العضلات وطول خيوط الميوسين)، ومورفولوجيا الميتوكوندريا (التعميم والحجم) لفهم آثار الطفرات الوراثية على هذه الهياكل الخلوية. ولا تقتصر هذه النُهج الكمية على التطبيقات الموصوفة هنا، حيث يمكن استخدامها بسهولة لتقييم شكل الأنسجة والعضيات الأخرى في الديدان الخيطية، وكذلك في الكائنات الحية النموذجية الأخرى.
Introduction
يستخدم على نحو متزايد الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans (C. elegans) كنظام نموذجي للكشف عن العمليات البيولوجية والجزيئية التي تنطوي عليها الأمراض البشرية. الديدان الخيطية الكبار لديه طول الجسم من ما يزيد قليلا على 1 ملم، ويمكنأن تنتج الحضنة كبيرة تصل إلى 300 بيضة 1. بعد الفقس، C. elegans تتطلب فقط 3-4 أيام للوصول إلى مرحلة البلوغ، ويعيش لحوالي 2 إلى 3 أسابيع2. نظرا لسهولة الزراعة، C. elegans هو حاليا واحدة من النماذج الحيوانية الأكثر رواجا في الجسم الحي لإجراء فحص فعال من حيث التكلفة والسريع للمخدرات لتحديد العلاجات للأمراض البشرية. بالإضافة إلى ذلك، فإن الحفاظ على الوراثة، والنماذج السلوكية المحددة جيدا، والجسم الشفاف للفلورة أو الفحص المجهري الخفيف، وسهولة التلاعب الجيني تجعل دراسة العواقب الخلوية والجزيئية للطفرات الوراثية قابلة لتحقيقها بسهولة 3. وC. elegans الجينوم يشارك ما يقرب من 60-80٪ علم الأنسجة مع الجينات البشرية، وحوالي 40٪ من تلك الجينات ومن المعروف أن تكون ذات صلة بالأمراض. بعض الأمراض البشرية التي تم نمذجة ودراسة في C. elegans تشمل الاضطرابات العصبية (مرض الزهايمر، مرض باركنسون، التصلب الجانبي الضموري، مرض شاركو ماري الأسنان)، الأمراض المرتبطة بالعضلات ( ضمور العضلات دوشين)، والأمراض الأيضية (فرط السكر في الدم)2،4. في معظم الاضطرابات البشرية، تحدث التعريب الخلوي والأعضاء الناجم عن الأمراض والتغيرات المورفولوجية، والتي يمكن تقييمها بسهولة في نموذج الديدان الخيطية.
وقد استخدمت علامات الفلورسنت على نطاق واسع لتسمية الأنسجة والعضيات للتصور الديناميكي تحت المجهر. ومع ذلك، في C. elegans، اعتمدت الأساليب التقليدية التي تقيّم المخالفات المورفولوجية بسبب الطفرات الوراثية إلى حد كبير على الأوصاف البصرية. في حين أن التقييمات النوعية يمكن أن تغطي نطاقات أوسع من الأوصاف الفينوتية (مورفولوجيا متشابك، تكتل GFP، شكل بديهي محدد، سمك الألياف العضلية، وما إلى ذلك) وتوفير وجهة نظر الطيور العين من التغيرات المورفولوجية، فهي أقل ملاءمة لل مقارنة الاختلافات الصغيرة عبر مجموعات مختلفة. وعلاوة على ذلك، تستند التقييمات النوعية إلى تقييم بصري وذاتي، مما قد يؤدي إلى تقدير التشوهات المورفولوجية تقديرا ً مفرطاً أو ناقصاً. وأخيرا، يمكن أن تختلف الملاحظات النوعية أيضا اختلافا كبيرا بين الأفراد، مما يخلق صعوبات في تكرار البيانات.
وفي السنوات الأخيرة، تم وضع عدد من الخوارزميات الحسابية السهلة الاستعمال والمتاحة بسهولة التي يمكنأن تحلل الصور كميا. ومع ذلك، فإن استخدام مثل هذه البرمجيات تحليل الصور لبعض الدراسات المورفولوجية، وخاصة فيما يتعلق عضلات جدار الجسم والميتوكوندريا، في C. elegans البحوث قد تخلفت. لتحسين التحليل الهيكلي الأساسي في C. elegans, تم تجريب بعض من البرمجيات المتاحة بسهولة, تحليل الصور مفتوحة المصدر لمقارنة كمية آثار الطفرات الوراثية على الميتوكوندريا العضلات, عضلة جدار الجسم ومتشابك مورفولوجيا. هذه الإجراءات التجريبية الخطوط العريضة بالتفصيل كيف يمكن استخدام هذه البرامج (فيجي، ilastik، CellProfiler، SQUASSH) لتقييم التغيرات في حجم متشابك وتوطين البروتين متشابك، منطقة العضلات جدار الجسم وطول الألياف، وحجم الميتوكوندريا وحجم الميتوكوندريا و التعميم نتيجة للطفرات الوراثية في الديدان الخيطية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكثيرا ً ما يتم تقييم الاختلافات المورفولوجية من خلال العد اليدوي للاختلافات الملحوظة أو باستخدام عتبات تعسفية لتحديد العيوب مقارنة بالنمط الظاهري الظاهري. ولكن في الآونة الأخيرة، استخدمت أساليب كمية للدراسات المقارنة للمورفولوجيا لقياس التغيرات على مستوى الخلايا ودون الخلوية ووصفها …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر نيومان على المناقشات القيمة والمدخلات. وقدمت بعض السلالات من قبل CGC، التي تمولها مكتب المعاهد الوطنية للصحة من برامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). يشكر المؤلفون WormBase على ثروتها من المعلومات عن C. elegans، وينوه موناش التصوير الصغير ، جامعة موناش ، لتوفير الأجهزة والتدريب والدعم التقني. وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح البحثية لـ CMTAA (2015 و2018)، ومنح مشروع NHMRC 1101974 و1099690 المقدمة إلى B.N.
Materials
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
- Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
- Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
- Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
- Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
- Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
- Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
- Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
- Teoh, J. -. S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
- Bird, T. D. . Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , (1998).
- Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
- Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
- Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
- Zhu, P. -. P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
- Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
- Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
- Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).
