Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar
Summary
Bu çalışmada, sinaptik boyut ve lokalizasyon, kas Morfoloji ve marochondrial şekil nicel ölçümler serbestçe kullanılabilir görüntü işleme araçları kullanarak C. elegans özetliyor. Bu yaklaşım, C. elegans ‘da gelecekteki çalışmaların, genetik mutasyonların bir sonucu olarak doku ve organel yapısal değişikliklerin kapsamını nicel olarak karşılaştırmasına olanak sağlar.
Abstract
Hastalığın altta yatan hücresel mekanizmaların tanımlanması, yeni teraplerin geliştirilmesi için önemlidir. Bu mekanizmaları çözmek için sık kullanılan bir strateji, aday genlerde mutasyonları tanıtmak ve dokuların ve hücresel organizlerin morfolojisindeki değişiklikleri niteliksel olarak tarif etmektir. Ancak, nitel açıklamaları ince fenosimik farklar yakalamayabilir, bir nüfusun bireyler arasında fenotipi varyasyonları yanlış gösterebilir, ve sıklıkla subjektif olarak değerlendirilir. Burada, nicel yaklaşımlar nematod Caenorhabditis elegans içinde dokuların ve organelilerin morfolojisi, ticari olarak mevcut biyo-görüntü işleme yazılımı ile birlikte lazer tarama konfetit mikroskopisi kullanarak incelemek için açıklanmıştır. Sinaps bütünlüğünü (boyut ve entegre floresan seviyeleri) etkileyen fenotiplerin nicel analizi, kas gelişimi (kas hücresi boyutu ve miyosin filament uzunluğu), ve mitokondriyal morfoloji (devre ve boyutu) anlamak için yapıldı Bu hücresel yapılarda genetik mutasyonların etkileri. Bu niceliksel yaklaşımlar, burada açıklanan uygulamalarla sınırlı değildir, çünkü Nematot ‘taki diğer dokuların ve organelların morfolojisini ve diğer model organizmalardaki gibi kolayca nicel olarak değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
Nematod Caenorhabditis elegans (C. elegans) , insan hastalığında yer alan biyolojik ve moleküler süreçleri ortaya çıkarmak için giderek bir model sistemi olarak kullanılmaktadır. Bir yetişkin nematod sadece 1 mm üzerinde bir vücut uzunluğu vardır ve 300 yumurta1kadar büyük bir damızlık üretebilir. Hatching sonra, C. elegans sadece yetişkin ulaşmak için 3-4 gün gerektirir ve yaklaşık 2 ila 3 hafta2için yaşamak. Kültür kolaylığı nedeniyle, C. elegans Şu anda insan hastalıkları için terapötik tanımlamak için maliyet-etkili, hızlı ilaç taraması yapmak için en çok aranan in vivo hayvan modellerinin biridir. Ayrıca, genetik koruma, iyi tanımlanmış davranışsal paradigmalar, floresan veya ışık mikroskobu için şeffaf vücut, ve genetik manipülasyon kolaylığı genetik mutasyonların hücresel ve moleküler sonuçlarının çalışma kolayca ulaşılabilir hale 3. C. elegans genom hisselerin yaklaşık% 60-80 insan genleri ile ortoloji ve bu genlerin yaklaşık% 40 ‘ i hastalık ile ilgili olduğu bilinmektedir. C. elegans modellenmiş ve okudu bazı insan hastalıkları nörodejeneratif bozukluklar (Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, amilotrofik lateral skleroz, Charcot-Marie-Tooth hastalığı), kas ilişkili hastalıklar ( Duchenne kas Distrofi) ve metabolik hastalıklar (hiperglisemi)2,4. Çoğu insan bozukluklarında, hastalığın kaynaklı hücresel ve organel lokalizasyonu ve morfolojik değişiklikler ortaya çıkar ve bu da Nematot modelinde kolayca değerlendirilebilecek.
Floresan işaretçileri mikroskopla dinamik görselleştirme için dokulara ve organelleri etiketlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, C. elegans, genetik mutasyonlar nedeniyle morfolojik düzensizlikleri değerlendirmek konvansiyonel yöntemler büyük ölçüde görsel açıklamaları üzerinde dayanmış. Nitel değerlendirmeler fenokolojik açıklamaların daha geniş aralıklarını (sinaptik morfoloji, Gfp kümelenme, spesifik akal şekli, kas lif kalınlığı, vb.) kapsayacak ve morfolojik değişikliklerin bir kuş bakışı görünümü sağlamak, onlar için daha az uygundur farklı gruplar arasında küçük varyasyonları karşılaştırarak. Ayrıca, niteliksel değerlendirmeler, morfolojik anomalilerin üzerinde veya daha fazla tahminine yol açabilecek görsel, subjektif değerlendirmeye dayanır. Son olarak, nitel gözlemler de bireyler arasında büyük farklılık gösterebilir, veri çoğaltma ile zorluklar yaratmak.
Son yıllarda, görüntüleri nicel olarak analiz edebilir Kullanıcı dostu, kolayca kullanılabilir Hesaplamalı algoritmalar bir dizi geliştirilmiştir. Ancak, bazı morfolojik çalışmalar için bu tür görüntü analiz yazılımının kullanımı, özellikle vücut duvar kasları ve mitokondri ile ilgili olarak, C. elegans araştırma arkasında gecikmiştir. C. eleganstemel yapısal analiz geliştirmek için, bazı hazır, açık kaynak görüntü analiz yazılımı niceliksel kas mitokondri üzerinde genetik mutasyonların etkilerini karşılaştırmak için trialed edildi, vücut duvar kas ve sinaptik Morfolojisi. Bu deneysel prosedürler ayrıntılı olarak nasıl bu programların (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) sinaptik boyutu ve sinaptik protein lokalizasyonu, vücut duvar kas alanı ve lif uzunluğu ve mitokondriyal boyutu değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir anahat ve Nematot genetik mutasyonlar sonucu olarak döngü.
Protocol
Representative Results
Discussion
Morfolojik varyasyonlar sıklıkla fark edilen farklılıklar el ile sayma veya vahşi tip fenotüre kıyasla kusurları belirlemek için rasgele eşikleri kullanarak değerlendirilir. Daha yakın zamanda, ancak, niceliksel Yöntemler, tarafsız bir şekilde hücresel ve subhücresel düzeyde değişiklikleri doğru ölçmek ve açıklamak için morfolojinin karşılaştırmalı çalışmaları için kullanılmıştır. Fenotürleri arasında ince henüz biyolojik olarak alakalı farklar tanımlamak için yeteneği çevr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz değerli tartışmalar ve giriş için Neumann Laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Bazı suşlar, NıH araştırma altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlandı. Yazarlar C. eleganshakkında bilgi zenginliği Için wormbase teşekkür, ve Monash Micro Imaging kabul, Monash Üniversitesi, enstrümantasyon sağlanması için, eğitim ve teknik destek. Bu çalışma CMTAA araştırma hibe (2015 ve 2018) ve NHMRC proje hibe tarafından desteklenmektedir 1101974 ve 1099690 B.N. verildi
Materials
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
- Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
- Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
- Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
- Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
- Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
- Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
- Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
- Teoh, J. -. S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
- Bird, T. D. . Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , (1998).
- Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
- Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
- Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
- Zhu, P. -. P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
- Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
- Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
- Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).
