Kwantitatieve benaderingen voor de studie van cellulaire structuren en organelle morfologie in Caenorhabditis elegans
Summary
Deze studie schetst kwantitatieve metingen van synaptische grootte en lokalisatie, spier morfologie, en mitochondriale vorm in C. elegans met behulp van vrij beschikbare beeldverwerkings hulpmiddelen. Deze aanpak maakt het mogelijk toekomstige studies in C. elegans te kwantificatief vergelijken de omvang van weefsel en organel structurele veranderingen als gevolg van genetische mutaties.
Abstract
Het definiëren van de cellulaire mechanismen onderliggende ziekte is essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe Therapeutics. Een strategie die vaak wordt gebruikt om deze mechanismen te ontrafelen, is het introduceren van mutaties in kandidaatgenen en het kwalitatief beschrijven van veranderingen in de morfologie van weefsels en cellulaire organellen. Kwalitatieve beschrijvingen kunnen echter geen subtiele fenotypische verschillen vertonen, kunnen de fenotypische variaties tussen individuen in een populatie verkeerd voorstellen en worden vaak subjectief beoordeeld. Hier worden kwantitatieve benaderingen beschreven om de morfologie van weefsels en organellen in de nematode Caenorhabditis elegans te bestuderen met behulp van laser scanning confocale microscopie in combinatie met commercieel verkrijgbare bio-beeld Verwerkingssoftware. Een kwantitatieve analyse van fenotypes die de synaps integriteit beïnvloeden (grootte en geïntegreerde fluorescentie niveaus), spierontwikkeling (spier Celgrootte en myosine filament lengte), en mitochondriale morfologie (circulariteit en grootte) werd uitgevoerd om te begrijpen de effecten van genetische mutaties op deze cellulaire structuren. Deze kwantitatieve benaderingen zijn niet beperkt tot de hier beschreven toepassingen, omdat ze gemakkelijk kunnen worden gebruikt om de morfologie van andere weefsels en organellen in de nematode, evenals in andere model organismen, te kwantificeerbare beoordeling.
Introduction
De nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) wordt steeds meer gebruikt als een modelsysteem om de biologische en moleculaire processen die betrokken zijn bij menselijke ziekten te ontdekken. Een volwassen nematode heeft een lichaamslengte van iets meer dan 1 mm en kan een grote broed van maximaal 300 eieren produceren1. Na het uitkomen, C. elegans vereisen slechts 3-4 dagen om volwassenheid te bereiken, en leven voor ongeveer 2 tot 3 weken2. Vanwege het gemak van het kweken, is C. elegans momenteel een van de meest gewilde in vivo diermodellen voor het uitvoeren van kosteneffectieve, snelle geneesmiddelen screening om therapieën voor menselijke ziekten te identificeren. Bovendien, de genetische instandhouding, goed gedefinieerde gedrags paradigma’s, transparante lichaam voor fluorescentie of lichte microscopie, en het gemak van genetische manipulatie maken de studie van cellulaire en moleculaire gevolgen van genetische mutaties gemakkelijk te Behaal bare 3. de C. elegans genoom deelt ongeveer 60-80% orthologie met menselijke genen, en ongeveer 40% van die genen staat bekend als ziekte-gerelateerd. Sommige van de menselijke ziekten die zijn gemodelleerd en bestudeerd in C. elegans omvatten neurodegeneratieve aandoeningen (de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, Amyotrofische laterale sclerose, Charcot-Marie-Tooth ziekte), spier-geassocieerde ziekten ( Spierdystrofie van Duchenne), en metabole ziekten (hyperglycemie)2,4. Bij de meeste menselijke aandoeningen, ziekte-geïnduceerde cellulaire en organel lokalisatie en morfologische veranderingen optreden, die gemakkelijk kunnen worden geëvalueerd in de nematode model.
Fluorescerende markers zijn op grote schaal gebruikt om weefsels en organellen te labelen voor dynamische visualisatie onder de Microscoop. In C. eleganshebben conventionele methoden die morfologische onregelmatigheden als gevolg van genetische mutaties beoordelen, zich echter grotendeels gebaseerd op visuele beschrijvingen. Hoewel kwalitatieve evaluaties een breder bereik van fenotypische beschrijvingen kunnen omvatten (synaptische morfologie, GFP-clumping, specifieke axonale vorm, dikte van de spiervezels, enz.) en een vogel beeld van de morfologische veranderingen bieden, zijn ze minder goed geschikt voor kleine variaties in verschillende groepen vergelijken. Bovendien zijn kwalitatieve evaluaties gebaseerd op een visuele, subjectieve evaluatie, die kan leiden tot overmatige of onderschattingen van morfologische afwijkingen. Ten slotte kunnen kwalitatieve waarnemingen ook sterk variëren tussen individuen, waardoor problemen ontstaan met gegevensreplicatie.
In de afgelopen jaren zijn een aantal gebruiksvriendelijke, gemakkelijk beschikbare computeralgoritmen ontwikkeld die afbeeldingen kwantitatief kunnen analyseren. Echter, het gebruik van dergelijke beeldanalyse software voor sommige morfologische studies, vooral met betrekking tot de spieren van het lichaam van de muur en de mitochondriën, in C. elegans onderzoek is achtergebleven achter. Ter verbetering van de onderliggende structurele analyse in C. elegans, sommige van de gemakkelijk beschikbare, open-source beeldanalyse software werden getrialed om kwantitatief te vergelijken de effecten van genetische mutaties op de spier mitochondriën, Body Wall spier en synaptische Morfologie. Deze experimentele procedures schetsen in detail hoe deze programma’s (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) kan worden gebruikt voor het evalueren van veranderingen in de synaptische grootte en synaptische eiwit lokalisatie, lichaam muur spier gebied en vezellengte, en mitochondriale grootte en circulariteit als gevolg van genetische mutaties in de nematode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Morfologische variaties zijn vaak beoordeeld via manuele telling van merkbare verschillen of met behulp van arbitraire drempels om defecten te bepalen in vergelijking met een wild type fenotype. Meer recentelijk zijn echter kwantitatieve methoden gebruikt voor vergelijkende studies van morfologie om op onpartijdige wijze veranderingen op cellulair en subcellulair niveau nauwkeurig te meten en te beschrijven. De mogelijkheid om subtiele maar biologisch relevante verschillen tussen fenotypes te identificeren is een krachti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken leden van het Neumann Lab voor waardevolle discussies en inbreng. Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure programma’s (P40 OD010440). De auteurs danken worm Base voor zijn rijkdom aan informatie over C. elegans, en erkennen Monash micro imaging, Monash University, voor de levering van instrumentatie, opleiding en technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door de CMTAA Research Grants (2015 en 2018), en NHMRC project Grants 1101974 en 1099690 toegekend aan B.N.
Materials
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
- Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
- Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
- Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
- Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
- Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
- Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
- Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
- Teoh, J. -. S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
- Bird, T. D. . Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , (1998).
- Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
- Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
- Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
- Zhu, P. -. P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
- Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
- Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
- Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).
