예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법
Summary
이 연구는 자유롭게 사용할 수있는 이미지 처리 도구를 사용하여 C. elegans에서 시냅스 크기와 현지화, 근육 형태 및 미토콘드리아 모양의 정량적 측정을 설명합니다. 이 접근은 C. elegans에 있는 미래 연구 결과가 유전 돌연변이 결과로 조직과 세포기관 구조 변경의 넓이를 정량적으로 비교하는 것을 허용합니다.
Abstract
근본적인 질병의 발달을 위한 세포 기계장치를 정의하는 것은 새로운 치료법의 발달을 위해 필수적입니다. 이 기계장치를 해명하기 위하여 빈번하게 이용되는 전략은 후보 유전자에 있는 돌연변이를 소개하고 조직과 세포 기관의 형태에 있는 변경을 질적으로 기술하기 위한 것입니다. 그러나, 질적 설명은 미묘한 표현형 차이를 포착하지 않을 수 있습니다, 인구에있는 개인에 걸쳐 표현형 변화를 잘못 표현 할 수 있습니다, 자주 주관적으로 평가된다. 여기서, 정량적 접근법은 시판되는 생체 이미지 처리 소프트웨어와 결합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 선충 제대인 예쁜꼬마선충에서 조직 및 소기관의 형태를 연구하기 위해 기술된다. 시냅스 무결성에 영향을 미치는 표현형의 정량적 분석(크기 및 통합 형광 수준), 근육 발달(근육 세포 크기 및 미오신 필라멘트 길이), 미토콘드리아 형태(원형 및 크기)를 이해하기 위해 수행되었습니다. 이 세포 구조에 유전 돌연변이의 효력. 이러한 정량적 접근법은 선충뿐만 아니라 다른 모델 유기체에서 다른 조직 및 세포기관의 형태를 정량적으로 평가하는 데 쉽게 사용될 수 있기 때문에 여기에 기술된 응용 분야에 한정되지 않는다.
Introduction
선충 제 Caenorhabditis (C. 예쁜 꼬마)는 점점 인간 질병에 관련 된 생물학적 및 분자 과정을 밝히기 위해 모델 시스템으로 활용. 성인 선충은 몸 길이가 1mm에 불과하며 최대 300 개의 계란1의 큰 무리를 생성 할 수 있습니다. 부화 후, C. 예쁜 꼬마는 성인기에 도달하는 데 3-4 일이필요하며 2 주 에서 2 주 정도 살 수 있습니다. 배양의 용이성 으로 인해, C. elegans는 현재 인간 질병에 대한 치료법을 식별하기 위해 비용 효율적이고 신속한 약물 스크리닝을 수행하기위한 생체 내 동물 모델 중 가장 인기있는 모델 중 하나입니다. 또한, 그것의 유전 보존, 잘 정의 된 행동 패러다임, 형광 또는 가벼운 현미경 검사법에 대한 투명한 몸, 유전 조작의 용이성은 쉽게 유전자 돌연변이의 세포 및 분자 결과의 연구를 쉽게 달성 할 수 3. C. elegans 게놈은 인간 유전자와 약 60-80 %의 정형 외과를 공유하며, 그 유전자의 약 40 %는 질병과 관련된 것으로 알려져 있습니다. C. 예쁜꼬마선충에서 모델링되고 연구된 몇몇은 신경퇴행성 질환 (알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 샤르코-마리-투스 질환), 근육 관련 질환( Duchenne 근 이영양증), 및 대사 성질환 (고혈당증) 2,4. 대부분의 인간 장애에서, 질병 유도 된 세포 및 세포 국소화 및 형태 학적 변화가 발생, 이는 선충 모델에서 쉽게 평가 될 수있다.
형광 마커는 현미경의 밑에 동적 시각화를 위한 조직 및 세포기관을 표지하기 위하여 널리 이용되었습니다. 그러나, C. elegans에서는,유전 돌연변이 때문에 형태학적 불규칙성을 평가하는 전통적인 방법은 시각적인 설명에 크게 의존했습니다. 질적 평가는 현상형 설명의 넓은 범위를 커버 할 수 있지만 (시냅스 형태, GFP 응집, 특정 축삭 모양, 근육 섬유 두께, 기타) 형태 변화의 조감도를 제공, 그들은 덜 적합 다른 그룹에 걸쳐 작은 변화를 비교. 또한, 정성적 평가는 형태학적 이상에 대한 과대 평가 또는 과소 평가로 이어질 수 있는 시각적, 주관적 평가를 기반으로 합니다. 마지막으로, 정성적 관찰은 개인마다 크게 달라질 수 있으므로 데이터 복제에 어려움을 겪을 수 있습니다.
최근에는 이미지를 정량적으로 분석할 수 있는 사용자 친화적이고 쉽게 사용할 수 있는 여러 가지 계산 알고리즘이 개발되었습니다. 그러나, C. elegans 연구에서, 특히 바디 벽 근육 및 미토콘드리아와 관련하여 몇몇 형태학 연구를 위한 그 같은 심상 분석 소프트웨어의 이용은 뒤쳐졌습니다. C. elegans에있는 근본적인 구조 분석을 개량하기 위하여는, 쉽게 유효한, 오픈 소스 심상 분석 소프트웨어의 몇몇은 근육 미토콘드리아, 바디 벽 근육 및 시냅스에 대한 유전 돌연변이의 효력을 정량적으로 비교하기 위하여 시험되었습니다 형태학. 이러한 실험 절차는 이러한 프로그램(피지, ilastik, CellProfiler, SQUASSH)이 시냅스 크기 및 시냅스 단백질 국소화, 신체 벽 근육 영역 및 섬유질 길이, 및 미토콘드리아 크기의 변화를 평가하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 자세히 설명하고, 선충에 있는 유전 돌연변이 결과로 원형.
Protocol
Representative Results
Discussion
형태학적 변화는 눈에 띄는 차이의 수동 계산을 통해 자주 평가되거나 야생 형 표현형에 비해 결함을 결정하기 위해 임의의 임계값을 사용하여 평가되었습니다. 그러나 최근에는 형태학의 비교 연구를 통해 세포 및 세포 내 하위 수준변화를 편견 없는 방식으로 정확하게 측정하고 설명하는 정량적 방법이 사용되고 있습니다. 표현형 간의 미묘하면서도 생물학적으로 관련된 차이를 식별하는 능력…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
노이만 연구소의 회원들에게 귀중한 토론과 의견을 주신 것에 감사드립니다. 일부 균주는 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무실 (P40 OD010440)에 의해 투자되는 CGC에 의해 제공되었다. 저자는 C. 예쁜 꼬마에대한 풍부한 정보에 대한 WormBase 감사, 모나시 마이크로 이미징인정, 모나시 대학, 계측의 제공에 대한, 교육 및 기술 지원. 이 작품은 CMTAA 연구 보조금 (2015 및 2018)에 의해 지원되었으며, NHMRC 프로젝트 보조금 1101974 및 1099690 B.N에 수여.
Materials
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
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