Quantitative Ansätze zur Untersuchung zellulärer Strukturen und Organelle Morphologie in Caenorhabditis elegans
Summary
Diese Studie skizziert quantitative Messungen der synaptischen Größe und Lokalisation, Muskelmorphologie und mitochondrialen Form in C. elegans mit frei verfügbaren Bildverarbeitungswerkzeugen. Dieser Ansatz ermöglicht es zukünftigen Studien in C. elegans, das Ausmaß der strukturellen Veränderungen von Gewebe und Organellen infolge genetischer Mutationen quantitativ zu vergleichen.
Abstract
Die Definition der zellulären Mechanismen, die der Krankheit zugrunde liegen, ist für die Entwicklung neuartiger Therapeutika von entscheidender Bedeutung. Eine Strategie, die häufig verwendet wird, um diese Mechanismen zu entwirren, besteht darin, Mutationen in Kandidatengenen einzuführen und Veränderungen in der Morphologie von Geweben und Zellorganellen qualitativ zu beschreiben. Qualitative Beschreibungen erfassen jedoch möglicherweise keine subtilen phänotiischen Unterschiede, können phänotypische Unterschiede zwischen Individuen in einer Population falsch darstellen und werden häufig subjektiv bewertet. Hier werden quantitative Ansätze beschrieben, um die Morphologie von Geweben und Organellen in der Nematode Caenorhabditis elegans mittels Laserscanning konfokale Mikroskopie in Kombination mit kommerziell erhältlicher Biobildverarbeitungssoftware zu untersuchen. Eine quantitative Analyse von Phänotypen, die die Synapsenintegrität (Größe und integrierte Fluoreszenzniveaus), die Muskelentwicklung (Muskelzellgröße und Myosin-Filamentlänge) und die mitochondriale Morphologie (Zirkularität und Größe) beeinflussen, wurde durchgeführt, um die Auswirkungen genetischer Mutationen auf diese zellulären Strukturen. Diese quantitativen Ansätze beschränken sich nicht auf die hier beschriebenen Anwendungen, da sie leicht zur quantitativen Bewertung der Morphologie anderer Gewebe und Organellen im Nematoden sowie in anderen Modellorganismen verwendet werden könnten.
Introduction
Die Nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) wird zunehmend als Modellsystem genutzt, um die biologischen und molekularen Prozesse aufzudecken, die an menschlichen Krankheiten beteiligt sind. Ein erwachsener Nematode hat eine Körperlänge von etwas mehr als 1 mm und kann eine große Brut von bis zu 300 Eiern1produzieren. Nach dem Schlüpfen benötigen C. elegans nur 3-4 Tage, um das Erwachsenenalter zu erreichen, und leben für etwa 2 bis 3 Wochen2. Aufgrund seiner einfachen Kultivierung ist C. elegans derzeit eines der begehrtesten In-vivo-Tiermodelle für die Durchführung kostengünstiger, schneller Arzneimittelscreenings zur Identifizierung von Therapeutika für menschliche Krankheiten. Darüber hinaus machen seine genetische Konservierung, gut definierte Verhaltensparadigmen, transparenter Körper für Fluoreszenz oder Lichtmikroskopie und die Leichtigkeit der genetischen Manipulation das Studium zellulärer und molekularer Folgen genetischer Mutationen leicht erreichbar. 3. Das Genom von C. elegans teilt etwa 60-80% Orthologie mit menschlichen Genen, und etwa 40% dieser Gene sind als krankheitsbedingt bekannt. Einige der menschlichen Krankheiten, die in C. elegans modelliert und untersucht wurden, sind neurodegenerative Erkrankungen (Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Tooth-Krankheit), muskelassoziierte Erkrankungen ( Duchenne-Muskeldystrophie) und Stoffwechselerkrankungen (Hyperglykämie)2,4. Bei den meisten menschlichen Störungen treten krankheitsinduzierte Zell- und Organellenlokalisierung und morphologische Veränderungen auf, die leicht im Nematodenmodell bewertet werden können.
Fluoreszierende Marker wurden häufig verwendet, um Gewebe und Organellen für die dynamische Visualisierung unter dem Mikroskop zu kennzeichnen. In C. elegansstützten sich konventionelle Methoden, die morphologische Unregelmäßigkeiten aufgrund genetischer Mutationen bewerten, jedoch weitgehend auf visuelle Beschreibungen. Während qualitative Bewertungen breitere Bereiche phänotypischer Beschreibungen abdecken können (synaptische Morphologie, GFP-Verklumpung, spezifische axonale Form, Muskelfaserdicke usw.) und eine Vogelperspektive auf die morphologischen Veränderungen bieten, eignen sie sich weniger gut für Vergleich kleiner Variationen zwischen verschiedenen Gruppen. Darüber hinaus basieren qualitative Bewertungen auf einer visuellen, subjektiven Bewertung, die zu einer Über- oder Unterschätzung morphologischer Anomalien führen kann. Schließlich können qualitative Beobachtungen auch zwischen Individuen sehr unterschiedlich sein, was zu Schwierigkeiten bei der Datenreplikation führt.
In den letzten Jahren wurden eine Reihe benutzerfreundlicher, leicht verfügbarer Rechenalgorithmen entwickelt, die Bilder quantitativ analysieren können. Allerdings ist die Verwendung solcher Bildanalyse-Software für einige morphologische Studien, insbesondere in Bezug auf Körperwandmuskeln und Mitochondrien, in C. elegans Forschung hinkt hinterher. Zur Verbesserung der zugrunde liegenden Strukturanalyse in C. eleganswurden einige der leicht verfügbaren Open-Source-Bildanalyse-Software erprobungsmittelmäßig untersucht, um die Auswirkungen genetischer Mutationen auf Muskelmitochondrien, Körperwandmuskel und Synaptikum quantitativ zu vergleichen. morphologie. Diese experimentellen Verfahren beschreiben im Detail, wie diese Programme (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) verwendet werden können, um Veränderungen der synaptischen Größe und synaptischen Proteinlokalisierung, Körperwandmuskelbereich und Faserlänge sowie mitochondriale Größe und Zirkularität als Folge genetischer Mutationen im Nematode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Morphologische Variationen wurden häufig durch manuelleS Zählen von spürbaren Unterschieden oder unter Verwendung beliebiger Schwellenwerte zur Bestimmung von Defekten im Vergleich zu einem Wildtyp-Phänotyp bewertet. In jüngerer Zeit wurden jedoch quantitative Methoden für vergleichende Studien der Morphologie verwendet, um Veränderungen auf zellulärer und subzellulärer Ebene unvoreingenommen genau zu messen und zu beschreiben. Die Fähigkeit, subtile, aber biologisch relevante Unterschiede zwischen Phänotypen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Neumann-Labors für wertvolle Diskussionen und Beiträge. Einige Stämme wurden von der CGC bereitgestellt, die vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Die Autoren danken WormBase für seine Fülle an Informationen über C. elegansund würdigen Monash Micro Imaging, Monash University, für die Bereitstellung von Instrumentierung, Ausbildung und technischer Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch CMTAA-Forschungsstipendien (2015 und 2018) und NHMRC-Projektstipendien 1101974 und 1099690 an B.N. unterstützt.
Materials
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
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