Kvantitative tilgange til at studere cellulære strukturer og organelle morfologi i Caenorhabditis elegans
Summary
Denne undersøgelse skitserer kvantitative målinger af synaptisk størrelse og lokalisering, muskel morfologi, og mitokondrie form i C. elegans ved hjælp af frit tilgængelige billedbehandling værktøjer. Denne fremgangsmåde gør det muligt for fremtidige studier i C. elegans at sammenligne omfanget af vævs-og organelle strukturændringer som følge af genetiske mutationer.
Abstract
Definition af cellulære mekanismer underliggende sygdom er afgørende for udviklingen af nye Therapeutics. En strategi, der ofte bruges til at afdække disse mekanismer, er at introducere mutationer i kandidat gener og kvalitativt beskrive ændringer i morfologien af væv og celle organeller. Kvalitative beskrivelser kan dog ikke opfange subtile fænotypiske forskelle, kunne forvanske fænotypiske variationer på tværs af individer i en population og ofte vurderes subjektivt. Her beskrives kvantitative tilgange til at studere morfologien af væv og organeller i fyrretræsnematoden Caenorhabditis elegans ved hjælp af Laserscanning confokal mikroskopi kombineret med kommercielt tilgængelige bio-image behandling software. En kvantitativ analyse af fænotyper, der påvirker synapse integritet (størrelse og integreret fluorescens niveauer), muskel udvikling (muskel Cellestørrelse og myosin filament længde), og mitokondrie morfologi (cirkularitet og størrelse) blev udført for at forstå virkningerne af genetiske mutationer på disse cellulære strukturer. Disse kvantitative tilgange er ikke begrænset til de anvendelser, der er beskrevet her, da de let kunne anvendes til kvantitativt at vurdere morfologien af andre væv og organeller i nematoden samt i andre modelorganismer.
Introduction
Fyrretræsnematoden Caenorhabditis elegans (C. elegans) udnyttes i stigende grad som et model system til at afdække de biologiske og molekylære processer, der er involveret i sygdomme hos mennesker. En voksen fyrretræsnematoden har en kropslængde på lidt over 1 mm, og kan producere en stor yngel på op til 300 æg1. Efter klækning kræver C. elegans kun 3-4 dage for at nå voksenalderen, og leve i omkring 2 til 3 uger2. På grund af sin lethed af dyrkning, C. elegans er i øjeblikket en af de mest eftertragtede in vivo dyremodeller for at gennemføre omkostningseffektiv, hurtig Drug screening for at identificere Therapeutics for menneskelige sygdomme. Desuden, dens genetiske bevaring, veldefinerede adfærdsmæssige paradigmer, gennemsigtige organ for fluorescens eller lys mikroskopi, og nem genetisk manipulation gør studiet af cellulære og molekylære konsekvenser af genetiske mutationer let opnåelige 3. C. elegans genom deler ca. 60-80% ortologi med menneskelige gener, og omkring 40% af disse gener er kendt for at være sygdomsrelaterede. Nogle af menneskelige sygdomme, der er blevet modelleret og undersøgt i C. elegans omfatter neurodegenerative lidelser (Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-tandsygdom), muskel-associerede sygdomme ( Duchenne muskeldystrofi), og metaboliske sygdomme (hyperglykæmi)2,4. I de fleste menneskelige lidelser opstår sygdoms induceret cellulær og organelle lokalisering og morfologiske forandringer, som let kan evalueres i fyrretræsnematoden modellen.
Fluorescerende markører har været meget brugt til at mærke væv og organeller til dynamisk visualisering under mikroskopet. Men i C. elegans, konventionelle metoder, der vurderer morfologiske uregelmæssigheder på grund af genetiske mutationer har i vid udstrækning påberåbt sig visuelle beskrivelser. Mens kvalitative vurderinger kan dække bredere intervaller af fænotypiske beskrivelser (synaptisk morfologi, GFP clumping, specifik axonal form, muskel fiber tykkelse, etc.) og give et fugleperspektiv af de morfologiske ændringer, de er mindre velegnede til sammenligning af små variationer på tværs af forskellige grupper. Desuden er kvalitative vurderinger baseret på visuel, subjektiv vurdering, hvilket kan føre til over-eller under estimeringer af morfologiske abnormiteter. Endelig kan kvalitative observationer også variere meget mellem individer, hvilket skaber problemer med datareplikering.
I de seneste år er der udviklet en række brugervenlige, let tilgængelige beregningsmæssige algoritmer, som kan analysere billeder kvantitativt. Men udnyttelsen af en sådan billedanalyse software til nogle morfologiske undersøgelser, især i forhold til kropsvæg muskler og mitokondrier, i C. elegans forskning har haltet bagud. For at forbedre underliggende strukturel analyse i C. elegans, nogle af de let tilgængelige, open-source billedanalyse software blev ved til kvantitativt sammenligne virkningerne af genetiske mutationer på muskel mitokondrier, Body Wall muskel og synaptisk Morfologi. Disse eksperimentelle procedurer skitsere i detaljer, hvordan disse programmer (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) kan bruges til at evaluere ændringer i synaptisk størrelse og synaptisk protein lokalisering, Body Wall muskel område og fiberlængde, og mitokondrie størrelse og cirkularitet som følge af genetiske mutationer i nematoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Morfologiske variationer er ofte blevet vurderet via manuel optælling af mærkbare forskelle eller ved hjælp af vilkårlige tærskler for at bestemme defekter i forhold til en vildtype fænotype. For nylig er der imidlertid blevet anvendt kvantitative metoder til sammenlignende undersøgelser af morfologi for nøjagtigt at måle og beskrive ændringer på et cellulært og subcellulært niveau på en upartisk måde. Evnen til at identificere subtile, men biologisk relevante forskelle mellem fænotyper er et effektivt mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmerne af Neumann Lab for værdifulde diskussioner og input. Nogle stammer blev leveret af CGC, som er finansieret af NIH kontor for forskning infrastrukturprogrammer (P40 OD010440). Forfatterne takker WormBase for sin rigdom af information om C. elegans, og anerkender Monash Micro Imaging, Monash University, for tilvejebringelse af instrumentering, uddannelse og teknisk support. Dette arbejde blev støttet af CMTAA-forskningsstipendier (2015 og 2018), og NHMRC-projekttilskud 1101974 og 1099690 blev tildelt B.N.
Materials
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
- Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
- Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
- Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
- Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
- Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
- Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
- Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
- Teoh, J. -. S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
- Bird, T. D. . Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , (1998).
- Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
- Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
- Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
- Zhu, P. -. P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
- Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
- Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
- Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).
