Kvantitative tilnærminger for Studying Cellular strukturer og organelle morfologi i Caenorhabditis elegans
Summary
Denne studien skisserer kvantitative målinger av Synaptic størrelse og lokalisering, muskel morfologi, og mitokondrie form i C. elegans bruke fritt tilgjengelige bildebehandlingsverktøy. Denne tilnærmingen gjør at fremtidige studier i C. elegans til kvantitativt sammenligne omfanget av vev og organelle strukturelle endringer som følge av genetiske mutasjoner.
Abstract
Definere cellulære mekanismer underliggende sykdom er avgjørende for utviklingen av romanen legemiddel selskap. En strategi ofte brukt til å løse disse mekanismene er å innføre mutasjoner i kandidat gener og kvalitativt beskrive endringer i morfologi av vev og cellulære organeller. Kvalitative beskrivelser kan imidlertid ikke fange subtile fenotypiske forskjeller, kan uriktige opplysninger fenotypiske variasjoner på tvers av individer i en befolkning, og er ofte vurdert subjektivt. Her er kvantitative tilnærminger beskrevet for å studere morfologi av vev og organeller i nematode Caenorhabditis elegans ved hjelp av laserskanning konfokalmikroskopi mikroskopi kombinert med kommersielt tilgjengelig bio-image prosessering programvare. En kvantitativ analyse av fenotyper som påvirker synapse integritet (størrelse og integrerte fluorescens nivåer), muskelutvikling (muskel Cellestørrelse og myosin filament lengde), og mitokondrie morfologi (sirkularitet og størrelse) ble utført for å forstå virkningene av genetiske mutasjoner på disse cellulære strukturer. Disse kvantitative tilnærmingene er ikke begrenset til programmene som er beskrevet her, da de lett kunne brukes til å kvantitativt vurdere morfologi av andre vev og organeller i nematode, så vel som i andre modell organismer.
Introduction
Den nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) blir i økende grad benyttet som et modell system for å avdekke de biologiske og molekylære prosessene som er involvert i menneskelig sykdom. En voksen nematode har en kropp lengde på litt over 1 mm, og kan produsere et stort kull på opptil 300 egg1. Etter klekking, C. elegans bare kreve 3-4 dager å nå voksen alder, og leve for rundt 2 til 3 uker2. På grunn av sin enkle dyrking, er C. elegans for tiden en av de mest ettertraktede in vivo dyremodeller for å gjennomføre kostnadseffektiv, rask narkotika screening for å identifisere legemiddel legemidler for menneskelige sykdommer. I tillegg sin genetiske bevaring, veldefinert atferds paradigmer, transparent kropp for fluorescens eller lys mikroskopi, og enkel genetisk manipulasjon gjør studiet av cellulære og molekylære konsekvenser av genetiske mutasjoner lett achieveable 3. The C. elegans Genova aksjer ca 60-80% orthology med menneskelige gener, og ca 40% av disse genene er kjent for å være sykdom-relatert. Noen av menneskelige sykdommer som har blitt modellert og studert i C. elegans inkluderer nevrodegenerative lidelser (Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sykdom), muskel-assosiert sykdommer ( Duchenne muskuløse dystrofi), og metabolske sykdommer (hyperglykemi)2,4. I de fleste menneskelige lidelser, sykdom-indusert cellulære og organelle lokalisering og morfologiske endringer oppstår, som lett kan evalueres i nematode modellen.
Fluorescerende markører har blitt mye brukt til å merke vev og organeller for dynamisk visualisering under mikroskopet. Men i C. elegans, konvensjonelle metoder som vurderer morfologiske uregelmessigheter på grunn av genetiske mutasjoner har i stor grad avhengig av visuelle beskrivelser. Mens kvalitative vurderinger kan dekke bredere spekter av fenotypiske beskrivelser (Synaptic morfologi, GFP klumper, spesifikk axonal form, muskel fiber tykkelse, etc.) og gir et fugleperspektiv av morfologiske endringer, de er mindre godt egnet for sammenligne små variasjoner på tvers av ulike grupper. Videre er kvalitative vurderinger basert på visuell, subjektiv evaluering, som kan føre til over-eller under estimater av morfologiske misdannelser. Til slutt kan kvalitative observasjoner også variere mye mellom individer, skape vanskeligheter med datareplikering.
I de senere årene, en rekke brukervennlige, lett tilgjengelige beregningsorientert algoritmer som kan kvantitativt analysere bildene er utviklet. Men, utnyttelse av slike bildeanalyse programvare for noen morfologiske studier, spesielt i forhold til kroppen veggen muskler og mitokondrier, i C. elegans forskning har ligget bak. For å forbedre underliggende strukturelle analyser i C. elegans, noen av de lett tilgjengelige, åpen kildekode bildeanalyse programvare ble trialed å kvantitativt sammenligne virkningene av genetiske mutasjoner på muskel mitokondrier, kropp veggen muskel og Synaptic Morfologi. Disse eksperimentelle prosedyrer skissere i detalj hvordan disse programmene (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) kan brukes til å evaluere endringer i Synaptic størrelse og Synaptic protein lokalisering, kropp veggen muskelområdet og fiber lengde, og mitokondrie størrelse og sirkularitet som følge av genetiske mutasjoner i nematode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Morfologiske variasjoner har ofte blitt vurdert via manuell telling av merkbare forskjeller eller ved hjelp av vilkårlige terskler for å fastslå defekter i forhold til en vill-type fenotype. Mer nylig har imidlertid kvantitative metoder blitt brukt for sammenlignende studier av morfologi til nøyaktig å måle og beskrive endringer på mobilnettet og subcellulære nivå på en upartisk måte. Evnen til å identifisere subtile, men biologisk relevante forskjeller mellom fenotyper er et kraftig middel for å forstå de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer av Neumann-laboratoriet for verdifulle diskusjoner og innspill. Noen stammer ble gitt av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure programmer (P40 OD010440). Forfatterne takker WormBase for sin vell av informasjon om C. elegans, og erkjenner Monash Micro Imaging, Monash University, for levering av instrumentering, opplæring og teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av CMTAA forskningsstipend (2015 og 2018), og NHMRC Project Grants 1101974 og 1099690 tildelt B.N.
Materials
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
References
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
- Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
- Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
- Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
- Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
- Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
- Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
- Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
- Teoh, J. -. S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
- Bird, T. D. . Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , (1998).
- Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
- Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
- Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
- Zhu, P. -. P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
- Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
- Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
- Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).
