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Biochemistry

ऑक्सीडेटिव तनाव के दौरान फाइब्रोनेक्टिन पर सेलुलर आडंशन की गतिशीलता और एपिथेलियल कोशिकाओं के प्रसार की जांच करना

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/59989
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Chemistry, High Point University, 3Biotechnology Program and the Department of Molecular Biomedical Sciences, North Carolina State University

Summary

इस विधि सेलुलर आसंजन के जल्दी गतिशीलता और फाइब्रोनेक्टिन पर लंगर पर निर्भर कोशिकाओं के प्रसार के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, इस परख सेल प्रसार और / या सेल आसंजन से संबंधित intracellular संकेतन रास्ते पर बदल redox homeostasis के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

कोशिकाओं का आसंजन और प्रसार कोशिकाओं को अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) पर होना जीव विकास के दौरान और वयस्क ऊतकों के होमियोस्टेसिस के लिए आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाएं हैं। दिलचस्प है, ऑक्सीडेटिव तनाव इन प्रक्रियाओं को बदल सकते हैं, इस प्रकार मेटास्टैटिक कैंसर जैसे रोगों के pathophysiology के लिए योगदान. इसलिए, कैसे कोशिकाओं को देते हैं और redox स्थिति में क्षोभ के दौरान ECM पर फैल के तंत्र को समझने के सामान्य और रोग राज्यों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. नीचे वर्णित एक कदम वार प्रोटोकॉल है कि एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस आधारित परख का इस्तेमाल करता है विशेष रूप से सेल आसंजन की मात्रा और फाइब्रोनेक्टिन पर अमर फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के प्रसार (FN) इन विट्रो में. संक्षेप में, लंगर पर निर्भर कोशिकाओं निलंबन में आयोजित कर रहे हैं और एटीएम kinase अवरोध करनेवाला Ku55933 के संपर्क में ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरित करने के लिए. कोशिकाओं तो FN लेपित सतह पर चढ़ाया जाता है और समय की पूर्व निर्धारित अवधि के लिए संलग्न करने की अनुमति दी. संलग्न रहने वाली कोशिकाओं को स्थिर किया जाता है और आसंजन (उदा., पैक्सिलिन) के फ्लोरोसेंट-आधारित एंटीबॉडी मार्कर ों के साथ लेबल किया जाता है और फैल जाता है (उदा., एफ-एक्टिन)। डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण आमतौर पर उपलब्ध प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं, एक epifluorscence माइक्रोस्कोप और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध फिजी सॉफ्टवेयर सहित. इस प्रक्रिया अत्यधिक बहुमुखी है और सेल लाइनों की एक किस्म के लिए संशोधित किया जा सकता है, ECM प्रोटीन, या inhibitors क्रम में जैविक सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए.

Introduction

सेल-मैट्रिक्स आसंजन (यानी, फोकल आसंजन) बड़े और गतिशील बहु-अणुक प्रोटीन परिसर हैं जो सेल आसंजन को मध्यस्थता करते हैं और फैलते हैं। इन प्रक्रियाओं ऊतक विकास, रखरखाव, और शारीरिक समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं. फोकल आसंजन झिल्ली से बंधे रिसेप्टर्स से बना रहे हैं, इस तरह के integrins के रूप में, साथ ही मचान प्रोटीन है कि cytoskeletal actin को extracellular मैट्रिक्स (ECM)1से लिंक. इन परिसरों विभिन्न संकेतन transduction रास्ते के सक्रियण के माध्यम से extracellular वातावरण में मौजूद भौतिक रासायनिक संकेतों का जवाब देने में सक्षम हैं. इस प्रकार, फोकल आसंजन निर्देशित प्रवास, सेल चक्र विनियमन, भेदभाव, और अस्तित्व1,2सहित सेलुलर प्रक्रियाओं की एक संख्या में extracellular यांत्रिक संकेतों का प्रचार करने के लिए संकेत केन्द्रों के रूप में सेवा करते हैं। संकेत अणुओं का एक समूह है कि विनियमित और फोकल आसंजन के साथ बातचीत छोटे GTPases के रो परिवार के सदस्य शामिल हैं. रो GTPases प्रमुख प्रोटीन है कि सेल प्रवास और आसंजन गतिशीलता उनके विशिष्ट spatiotemporal सक्रियण3के माध्यम से विनियमित कर रहे हैं. आश्चर्य नहीं कि रो प्रोटीन समारोह के डिस्रेगेशन को मेटास्टेसिस, एंजियोजेनेसिस, और अन्य जैसे कई मानव रोगों में फंसाया गया है। विशेष रुचि की, सेलुलर redox स्थिति सेल प्रवास और आसंजन के मॉडुलन में एक प्रमुख भूमिका निभाता है. रेडॉक्स होमोस्टेसिस में परिवर्तन, जैसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) में वृद्धि, रो प्रोटीन गतिविधि को विनियमित करने के लिए प्रदर्शन किया गया है, साथ ही आसंजन, सेल प्रकार और मानव रोगों की एक संख्या में4,5,6 ,7,8. उदाहरण के लिए, स्नायविक विकार ataxia-telangiectasia (ए-टी) से पीड़ित व्यक्तियों, जो डीएनए क्षति की मरम्मत serine में एक उत्परिवर्तन के कारण होता है/ 10| इन रोगियों और सेल लाइनों में एटीएम काइनेज गतिविधि की हानि, या तो आनुवंशिक उत्परिवर्तन या रासायनिक निषेध के माध्यम से, पेंटोस फॉस्फेट मार्ग7,11, के रोग के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव के उच्च स्तर में परिणामहै , 12. इसके अलावा, प्रयोगशाला से हाल के अध्ययनों से साइटोस्केलेटल गतिशीलता (यानी आसंजन और प्रसार) को इन विट्रो5में रो परिवार GTPases को सक्रिय करने का एक सीधा परिणाम के रूप में एक-टी में ROS के लिए एक pathophysiological भूमिका पर प्रकाश डाला गयाहै। अंत में, रो परिवार के सक्रियण के कारण साइटोस्केलेटल गतिशीलता में इन परिवर्तनों से ए - टी रोगियोंमेंनोट किए गए मेटास्टैटिक कैंसर का खतरा बढ़ सकता है5 ,13. इसलिए, ऑक्सीडेटिव तनाव के दौरान सेल-मैट्रिक्स बातचीत के बीच परस्पर क्रिया को समझने आसंजन और प्रसार के विनियमन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. इन अध्ययनों से भी इन संकेतन प्रक्रियाओं में Rho परिवार GTPases के लिए एक संभावित भूमिका में आगे की जांच के लिए मंच निर्धारित कर सकते हैं.

इसके साथ वर्णित एक प्रोटोकॉल आसंजन विधानसभा के प्रारंभिक सेलुलर गतिशीलता का अध्ययन करने और एटीएम kinase गतिविधि के निषेध के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव के दौरान फैल रहा है. यह परख ईसीएम प्रोटीन फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) के लिए लंगर-निर्भर कोशिकाओं आसंजन की अच्छी तरह से विशेषता तंत्र पर आधारित है। जब निलंबन में बनाए रखा कोशिकाओं FN पर चढ़ाया जाता है, कई Rho GTPasses actin cytoskeletal remodeling3,14के नियंत्रण समन्वय . रूपात्मक परिवर्तन ों को देखा जाता है क्योंकि कोशिकाएं गोल और वृत्ताकार से उपस्थिति में चपटा और विस्तारित होती हैं। इन टिप्पणियों के साथ संगत ECM के साथ कई मैट्रिक्स आसंजन का विकास है. इन परिवर्तनों का कारण पहले घंटे के दौरान राक1 के साथ RhoA के द्वि-फासी सक्रियण के लिए दिया जाता है क्योंकि कोशिकाएं 15,16का पालन और प्रसार करते हैं .

तरीकों की एक किस्म आसंजन आकृति विज्ञान और गतिशीलता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल प्रसार की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है। हालांकि, इन तरीकों परिष्कृत दीर्घकालिक, लाइव-इमेजिंग कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरोसेंट (TIRF) या confocal माइक्रोस्कोपी सिस्टम पर भरोसा करते हैं। इस प्रकार, उपयोगकर्ताओं को विशेष उपकरणों और सॉफ्टवेयर के लिए उपयोग किया जाना चाहिए. इसके अलावा, इन बायो-इमेजिंग सिस्टम द्वारा आवश्यक सेट-अप समय प्रारंभिक आसंजन घटनाओं को चुनौती देने में, खासकर जब कई अवरोधकों या उपचार की स्थिति का समवर्ती परीक्षण करता है।

विस्तृत तरीके, इसके साथ, आसंजन विधानसभा को नियंत्रित करने और विट्रो में फैलने वाले मापदंडों का आकलन करने के लिए एक सरल, किफायती, अभी तक मात्रात्मक तरीका प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल आमतौर पर उपलब्ध प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग कर के लिए किया जाता है, इस तरह के एक epifluorscence माइक्रोस्कोप और सीसीडी कैमरा के रूप में. इस परख में एटीएम काइनेज गतिविधि के रासायनिक अवरोध के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव की अवधि के बाद एक एफएन लेपित सतह पर लंगर-निर्भर कोशिकाओं को लागू करना शामिल है, जोपहलेसे 5 प्रदर्शित किया गया है। चढ़ाना के बाद, कोशिकाओं को संलग्न और समय की निर्दिष्ट लंबाई के लिए पालन करने के लिए अनुमति दी जाती है। असंबद्ध कोशिकाओं को धोया जाता है, जबकि संलग्न कोशिकाओं को स्थिर किया जाता है और आसंजन (उदा., पैक्सिलिन) के मार्करों के लिए फ्लोरोसेंट आधारित एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है और फैल जाता है (उदा., एफ-एक्टिन)2,5। इन प्रोटीनों की कल्पना की जाती है और एपिफ्लोरेसीन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके रिकॉर्ड किया जाता है। बाद डेटा विश्लेषण स्वतंत्र रूप से उपलब्ध फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है. इसके अलावा, इस विधि विभिन्न ECM प्रोटीन सहित शर्तों की एक विस्तृत श्रृंखला के तहत आसंजन गतिशीलता की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, विभिन्न oxidants / सेल संस्कृति की स्थिति या लंगर पर निर्भर सेल लाइनों की एक किस्म के साथ उपचार की एक विस्तृत श्रृंखला को संबोधित करने के लिए जैविक सवाल.

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Protocol

1. तैयारी

नोट: नीचे वर्णित प्रोटोकॉल REF52 कोशिकाओं और एटीएम+ / + या एटीएम- मानव फाइब्रोब्लास्ट के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है। अन्य कक्ष प्रकारों को नीचे दिए गए नोट्स और समस्या निवारण अनुभागों में वर्णित के अनुसार आगे ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता हो सकती है.

  1. REF52 कोशिकाओं के लिए पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम के 500 एमएल बनाओ. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) युक्त उच्च-ग्लूकोज के 500 एमएल करने के लिए 10% एफबीएस, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, और 100 इकाइयों /
  2. फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) का 25 ग्राम/एमएल घोल 1 मिलीग्राम/एमएल एफएन विलयन को 12 एमएल तक 12 एमएल तक जोड़कर, 12 एमएल बंधीय 1x फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस), पीएच 7.4 को जोड़कर एक 25 ग्राम/एमएल घोल तैयार की जा रही है। अच्छी तरह मिला लें।
  3. सीरम मुक्त DMEM सेल संस्कृति माध्यम में एक 0.5% (w/v) delipidated (यानी, फैटी एसिड मुक्त) गोजातीय सीरम एल्बुमिन (dlBSA) समाधान तैयार करें। सीरम मुक्त DMEM माध्यम के 100 एमएल करने के लिए dlBSA के 0.5 ग्राम जोड़ें. घोल को अच्छी तरह मिलाएं, लेकिन भंवर मत करो। बाँझ एक नया बाँझ कंटेनर में समाधान फिल्टर, उपयोग करने से पहले एक 0.22 $M सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. 1x पीबीएस के 100 एमएल में 3.7 ग्राम पैराफॉर्मेल्डिहाइड को भंग करके 3.7% पैराफॉर्मेल्डिहाइड समाधान करें। हल में paraformaldehyde पाने के लिए कोमल गर्मी और सरगर्मी का प्रयोग करें।
    नोट: paraformaldehyde समाधान प्रकाश संवेदनशील है और प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए. यह एक सप्ताह तक के लिए अच्छा है जब 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
    चेतावनी: पैराफॉर्मेल्डिहाइड विषाक्त, ज्वलनशील, संक्षारक और एक स्वास्थ्य खतरा है। उपयोग करने से पहले पैराफॉर्मेल्डिहाइड के लिए सामग्री सुरक्षा डेटा शीट की समीक्षा करें। उचित व्यक्तिगत सुरक्षाउपकरणों का उपयोग करें जब आंख ढाल, चेहरा ढाल, पूर्ण चेहरा कण श्वसन यंत्र, दस्ताने, और प्रयोगशाला कोट सहित हैंडलिंग.
  5. 1x पीबीएस (v/v) में 0.2% गैर-आयनिक सर्फैक्टेंट युक्त permebilization समाधान तैयारकरें। 100 एमएल के लिए, धीरे-धीरे सरगर्मी करते समय, 1x पीबीएस के 100 एमएल में ट्राइटन एक्स-100 के 0.2 एमएल जोड़ें।
  6. इम्यूनोफ्लोरेसेंस ब्लॉकिंग बफर जिसमें 2.5% बीएसए, 5% बकरी सीरम, और 0.05% गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट (w/v/v) 1x पीबीएस समाधान में भंग कर दें। 100 एमएल के लिए, 5 एमएल बकरी सीरम, 2.5 ग्राम बीएसए और 0.05 एमएल ट्राइटन एक्स-100 में $ 95 एमएल 1x पीबीएस जोड़ें, जबकि सरगर्मी।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में एक 10 सेमी2 (या किसी भी अन्य पोत आकार) सेल संस्कृति का इलाज प्लेट में डीएमईएम पूर्ण संस्कृति माध्यम मेंREF52कोशिकाओं को बढ़ाएँ।

2. extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन फाइब्रोनेक्टिन के साथ कोटिंग सेल संस्कृति प्लेटें

नोट: एक बीएसएल-2 प्रमाणित laminar प्रवाह हुड में aseptic तकनीक और बाँझ अभिकर्मकों का उपयोग कर इस अनुभाग प्रदर्शन. आरंभ से पहले मुख्य चरणों के ओवरव्यू के लिए चित्र 1A देखें.

  1. एक ऊतक संस्कृति प्रमाणित 24 अच्छी तरह से थाली का उपयोग करना, प्रत्येक अच्छी तरह से एक गिलास coverslip (12-Cir-1) जगह है. चित्र 1खके अनुसार प्लेट को लेबल करें।
  2. 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कूप के लिए 25 ग्राम/एमएल एफएन समाधान का पिपेट 500 डिग्री सेल्सियस।
  3. पिपेट प्रत्येक coverslip पर समाधान भी कोटिंग और पूरा पनडुब्बी सुनिश्चित करने के लिए कुछ समय. ढक्कन को प्लेट पर वापस रखें।
  4. एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 में 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. 1 ज के बाद, इनक्यूबेटर से प्लेट को हटा दें और कुएं से एफएन समाधान को प्रेरित करें।
  6. 1x पीबीएस के 500 डिग्री एल के साथ तीन बार कुओं को धोएं। 1x पीबीएस के अंतिम धोने के लिए प्रेरित.
  7. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर कम से कम 15 मिनट के लिए 0.5% dlBSA समाधान के 500 $L के साथ ब्लॉक कुओं .
  8. नीचे दिए गए चरण 3 में कोशिकाओं चढ़ाना करने से पहले dlBSA समाधान प्रेरित करें।
    नोट: प्लेट्स भंडारण, dlBSA समाधान की आकांक्षा के बाद प्रत्येक coverslip करने के लिए 1x PBS के 500 $L जोड़ें। प्लेट्स तो एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है.

3. आसंजन परख के लिए लंगर पर निर्भर कोशिकाओं की तैयारी

नोट: एक बीएसएल-2 प्रमाणित laminar प्रवाह हुड में aseptic तकनीक और बाँझ अभिकर्मकों का उपयोग कर इस अनुभाग प्रदर्शन.

  1. कम से कम 30 मिनट सेल चढ़ाना से पहले, पूर्व गर्म निम्नलिखित समाधान: DMEM पूरा माध्यम, dlBSA समाधान, 1x पीबीएस, 0.5% trypsin-EDTA समाधान, और trypsin एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में सीरम (TNS) तटस्थ.
  2. एक 10 सेमी2 पकवान में REF52 कोशिकाओं के एक confluent monolayer के साथ शुरू, गर्म 1x पीबीएस के 6 एमएल के साथ दो बार कोशिकाओं को धोने. सीरम 37 डिग्री सेल्सियस और 5% ब्व्2पर गर्म dlBSA समाधान के 6 एमएल में कम से कम 1 एच (सेल प्रकार के आधार पर) के लिए कोशिकाओं भूखा।
  3. गर्म 1x पीबीएस के 6 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें, एस्पायर पीबीएस और गर्म 0.5% ट्रिप्सिन-EDTA समाधान के 1.5 एमएल जोड़ें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में कोशिकाओं प्लेस और $ 2 मिनट के लिए 5% सीओ2।
  5. टुकड़ी पूरा हो गया है यह सुनिश्चित करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। यदि कोशिकाओं को अभी भी बेंच के शीर्ष पर प्लेट दोहन के बाद अनुयायी हैं, एक अतिरिक्त 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर लौटने. के रूप में कम समय के लिए कोशिकाओं trypsinize आवश्यक है.
  6. पिपेट 1.5 एमएल गर्म ट्रिप्सिन तटस्थ समाधान (TNS) trypsinization को रोकने के लिए और अलग कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए पकवान करने के लिए। सभी शेष अनुलग्न कोशिकाओं को हटाने के लिए प्लेट के नीचे कई बार ऊपर और नीचे समाधान को पिपेट करें। यदि कोशिकाएं clumpy दिखाई देती हैं, तो आगे धीरे से ऊपर और नीचे पकवान के पीछे पाइपिंग द्वारा सेल निलंबन triturate.
  7. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत trypan नीले बहिष्करण और एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना। वैकल्पिक रूप से, किसी स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करें।
  8. एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में dlBSA के 5 एमएल में एक 1.0 - 3.0 x 104 कोशिकाओं /एमएल सेल निलंबन बनाने के लिए कोशिकाओं की एक उचित राशि निकालें।
  9. एक टेबल-टॉप अपकेंद्रित्र में एक निश्चित कोण रोटर का उपयोग कर 5 मिनट के लिए $ 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं।
  10. सेल गोली से supernatant aspirate, और गर्म dlBSA समाधान की कुल 7 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित. कोशिकाओं को कवरस्लिप चढ़ाना पर अधिक प्रभाव न होने दें, लेकिन समान रूप से एक-दूसरे को छूने वाली कुछ कोशिकाओं के साथ वितरित करें।
  11. शाम को सेल निलंबन को दो 15 एमएल शंकु ट्यूबों में विभाजित करें, एक वाहन के लिए अकेले नियंत्रण (डीएमएसओ) और एक Ku55933 (एटीएम kinase अवरोधक, ऑक्सीडेंट)5के लिए। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक ट्यूब सेल निलंबन के 3.5 एमएल शामिल हैं।
  12. एक ट्यूब रोटेटर का उपयोग करके, एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 90-120 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों घूमना।
  13. चढ़ाना से पहले 30 मिनट, प्रत्येक संबंधित ट्यूब के लिए 10 डिग्री एम Ku55933 और DMSO (1:1,000) की एक अंतिम एकाग्रता जोड़ें। सेल निलंबन को शेष समय के लिए रोटेटर पर वापस रखें।
  14. कोशिकाओं को चढ़ाना से ठीक पहले, इनक्यूबेटर से 24-वेल प्लेट को पुनः प्राप्त करें और dlBSA समाधान को प्रेरित करें।
  15. 90-120 मिनट के लिए सेल निलंबन घूमने के बाद, प्रत्येक उपचार समूह से सेल निलंबन के 500 डिग्री सेल्सियस को हटा दें और चरण 2 से 24-वेल प्लेट में एक एफ एन लेपित कवरस्लिप में सचित्र के रूप में (चित्र 1B) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 सेल संस्कृति इनक्यूबेटर और सेल निलंबन को वापस रोटेशन पर वापस लौटें।
  16. FN कवर कवर-कवरलिप्स पर सेल निलंबन चढ़ाना के बाद, कोशिकाओं को समय की वांछित लंबाई (जैसे, 10 मिनट, 15 मिनट, 20 मिनट, 30 मिनट) का पालन करने की अनुमति दें और फिर तुरंत चरण 4 पर जाएं।

4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए सेल निर्धारण और एंटीबॉडी धुंधला

नोट: निम्नलिखित चरणों गैर बाँझ शर्तों के तहत और कमरे के तापमान पर जब तक अन्यथा कहा गया है प्रदर्शन कर रहे हैं।

  1. आसंजन के लिए वांछित समय बीत जाने के बाद, प्लेट में प्रत्येक कवरस्लिप से सेल समाधान को प्रेरित करें।
  2. अच्छी तरह से के पक्षों का उपयोग करना, धीरे प्रत्येक coverslip पर 3.7% paraformaldehyde समाधान के 500 $L वितरित और 10-15 मिनट प्रतीक्षा करें.
  3. पैराफॉर्मेल्डिहाइड समाधान निकालें और कुल दो बार पीबीएस के 500 डिग्री सेल्सियस के साथ प्रत्येक कवरस्लिप को धोएं।
    नोट: संस्था की पर्यावरण स्वास्थ्य और सुरक्षा योजना के अनुसार, जिम्मेदारी से पैराफॉर्मेल्डिहाइड कचरे का निपटान करें।
  4. पीबीएस को प्रेरित करें, और कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए 0.2% ट्राइटन एक्स-100 के 500 डिग्री सेल्सियस के साथ प्रत्येक कवरस्लिप पर कोशिकाओं को प्रेरित करें।
  5. 1x पीबीएस के 500 डिग्री सेल्सियस के साथ तीन बार प्रत्येक कवरस्लिप धोएं।
  6. 5% बकरी सीरम युक्त बफर ब्लॉकिंग बफर के साथ प्रत्येक कवरस्लिप पर ब्लॉक कोशिकाओं, 2.5% बीएसए और 0.05% ट्राइटन एक्स-100 30-60 मिनट के लिए एक 1 एक्स पीबीएस समाधान में भंग।
  7. अवरुद्ध बफर में प्राथमिक एंटी-पैक्सिलिन एंटीबॉडी (1:250) को पतला करें। अच्छी तरह से मिलाएं और प्रत्येक कवरस्लिप के लिए एंटीबॉडी समाधान के 200 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। कम से कम 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जा सकता है। आसंजन परिसरों और बाद में एफए विश्लेषण धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कई आम फोकल आसंजन मार्करों रहे हैं। इनमें निम्नलिखित प्रोटीनों के विरुद्ध एंटीबॉडी शामिल हैं: उपइकाइयों ($1, $5, या $V), टैलिन, या विन्कुलिन2.
  8. एंटीबॉडी समाधान aspirate, और 1x PBS के 500 डिग्री सेल्सियस के साथ प्रत्येक coverslip धोने के लिए तीन बार 10 मिनट प्रत्येक. आगे इस बिंदु से प्रकाश से नमूने को सुरक्षित रखें.
  9. एक ही बफर अवरुद्ध समाधान में लाल फ्लोरोमिन एफ-एक्टिन जांच को लाल फ्लोरोसेंट एलेक्सा 594 डाई (1:1000) और बकरी-एंटी माउस 488 फ्लोरोसेंट सेकेंडरी एंटीबॉडी (1:400) को मिला दिया। अच्छी तरह से मिलाएं और 30 मिनट के लिए प्रत्येक कवरस्लिप के लिए एंटीबॉडी समाधान के 200 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    नोट: अन्य प्रजातियों से Fluorescently संयुग्मी माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, अन्य प्रजातियों से एंटीबॉडी के उपयोग अवरुद्ध बफर सीरम के संशोधन की आवश्यकता होगी.
  10. एंटीबॉडी समाधान aspirate, और 1x PBS के 500 डिग्री सेल्सियस के साथ प्रत्येक coverslip धोने के लिए तीन बार 10 मिनट प्रत्येक.
  11. 1x पीबीएस प्रेरित और dIH2हे के 500 $L के साथ एक बार कुल्ला.
  12. DAPI युक्त विरोधी फीका बढ़ते माध्यम का उपयोग कर माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट covers.
  13. कमरे के तापमान पर अंधेरे में रात भर सेट करने के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड छोड़ दें।
  14. लंबी अवधि के भंडारण के लिए और इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर माइक्रोस्कोप स्लाइड।
    नोट: मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीकों का उपयोग कर छवि। यह सेल किनारों पर फोकल आसंजन और परिधीय ruffles नोट करने के लिए पर्याप्त संकल्प सुनिश्चित करने के लिए एक उच्च स्तरीय तेल विसर्जन 60x उद्देश्य लेंस का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। प्रत्येक उपचार की स्थिति और समय के तहत प्रत्येक कवरस्लिप के लिए देखने के कई क्षेत्रों में 20-30 कोशिकाओं की छवियों का अधिग्रहण। संयुक्त प्रतिकृति से, यह सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए कम से कम 60 कोशिकाओं को प्राप्त करना चाहिए। सहेजें और एक के रूप में फ्लोरोसेंट छवियों का निर्यात। TIFF फ़ाइल 300 dpi रिज़ॉल्यूशन की एक न्यूनतम के साथ।

5. परिमाणात्मक तनाव फाइबर, सेल परिपत्र, और फोकल आसंजन गठन

नोट: निम्नलिखित छवि विश्लेषण खुला स्रोत इमेजिंग प्रसंस्करण पैकेज फिजी बस छवि जम्मू (फिजी), जो (http://fiji.sc/) पर नि: शुल्क डाउनलोड किया जा सकता है के नवीनतम संस्करण का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं.

  1. सामान्य छवि संसाधन
    Note: सभी छवियों को संगणकीय विश्लेषण के लिए तैयार करने की आवश्यकता होगी चरणों का प्रदर्शन 5.1.1-5.1.5 नीचे (चित्र 2)। इसके बाद, किसी भी या सभी बाद परिमाणीकरण प्रक्रियाओं का चयन किया जा सकता है.
    1. खोलें. फिजी का उपयोग कर झगड़ा फ्लोरोसेंट छवि. सुनिश्चित करें कि छवियाँ 8-बिट और स्केल हैं।
    2. छवि-समायोजित-विंडो/स्तर का चयन करें और स्वत: का चयन करें (चित्र 2A).
    3. पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट घटाने के लिए प्रक्रिया-सबट्रैक पृष्ठभूमि का चयन करें. स्लाइडिंग पैराबोलॉयड की जाँच करें और 50 पिक्सेल(चित्र 2B)के रोलिंग बॉल त्रिज्या के विकल्प का चयन करें।
      नोट: रोलिंग बॉल त्रिज्या के लिए उचित आकार सत्यापित करने के लिए, रेखा उपकरण का चयन करें और छवि में सबसे बड़ा आसंजन पर एक त्रिज्या आकर्षित। तैयार की गई रेखा की लंबाई सत्यापित करने के लिए माप का चयन करें. यदि त्रिज्या का मान बहुत बड़ा है, तो आसंजन सहित सुविधाएँ छवि में खो जाएँगी. त्रिज्या बहुत छोटा है, तो यह पृष्ठभूमि शोर के कारण संसाधित छवि में कलाकृतियों को जन्म दे देंगे।
    4. पृष्ठभूमि पर आसंजन की तीव्रता की जांच करने के लिए छवि-समायोजित- चमक/ यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें।
      नोट: चमक का अनुकूलन करने के लिए /
    5. विश्लेषण सेट मापके अंतर्गत निम्नलिखित पैरामीटर ों का चयन करें: क्षेत्र, मामीन ग्रे मान, आकृति डिस्क्रिप्टर, और एकीकृत घनत्व.
  2. तनाव फाइबर गठन विश्लेषण
    नोट: तनाव फाइबर phenotype के आधार पर कई मायनों में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.
    1. कोशिकाओं की कुल संख्या पर एक प्रतिशत के रूप में तनाव फाइबर के साथ कोशिकाओं की संख्या की गणना. यह विश्लेषण सबसे अच्छा है अगर वहाँ तनाव विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत गठित फाइबर की संख्या में दृश्य मतभेद हैं.
    2. तनाव फाइबर है कि सेल अनुप्रस्थ की संख्या की गणना. इस विश्लेषण के प्रति सेल का गठन तनाव फाइबर की संख्या की तुलना के लिए अनुमति देता है.
    3. फलादीन द्वारा दी गई कुल फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापें (उदाहरण के लिए, एफ-एक्टिन) प्रति सेल17,18धुंधला । इस विधि में एफ-एक्टिन धुंधला होने के कारण फ्लोरोसेंट तीव्रता में भारी वृद्धि/कमेंस को उजागर किया जाएगा।
      1. माप पैरामीटर चरण 5.1.5 में ऊपर सेट करें.
      2. फिजी उपकरण पट्टी में Freehand उपकरण का चयन करें और मैन्युअल रूप से ब्याज की सेल (ओं) का पता लगाने. विश्लेषण-मापका चयन करें. चयनित माप पैरामीटर दिखाने के लिए एक नई विंडो दिखाई देगी.
      3. फिजी उपकरण पट्टी में Freehand उपकरण का चयन करें और मैन्युअल रूप से कोई कक्ष मौजूद के साथ एक रिक्त स्थान का पता लगाने। विश्लेषण-मापका चयन करें. इस माप पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट के रूप में काम करेगा.
      4. सेल प्रति कुल एफ-एक्टिन फ्लोरोसेंट निर्धारित करने के लिए नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करें:
        Equation 1
        नोट: जिसके परिणामस्वरूप माप सामान्यीकृत किया जा सकता है और सेल प्रति एफ-actin फ्लोरोसेंट देने के लिए अन्य कोशिकाओं की तुलना में।
  3. कोशिका वृत् तीयता विश् लेषण
    नोट: सेल क्षेत्र पर जानकारी (समय के साथ फैल सेल का एक संकेतक), साथ ही, परिपत्र भी दर्ज किया जा सकता है. यह माप क्रमशः गोल करने के लिए लम्बी कोशिकाओं को परिमाणित करने के लिए एक तरीका के रूप में 0 से 1 के बीच एक अनुपात के रूप में दिया जाता है।
    1. फिजी उपकरण पट्टी में फ्रीहैंड उपकरण का चयन करें, और किसी व्यक्तिगत कक्ष का पता लगाएँ. छवि-माप का चयन करें और प्रत्येक कक्ष के लिए कक्ष क्षेत्र और परिमाप माप रिकॉर्ड करें. प्रत्येक कक्ष के लिए इस कार्यविधि को दोहराएँ.
      नोट: सेट मापन फ़ंक्शन के अंतर्गत, परिपत्र आकृति डिस्क्रिप्टर माप (चरण 5.1.5) के रूप में प्रदान किया गया है।
    2. चित्र 3 और चित्र 4में दर्शाए अनुसार प्रति सेल में मैनुअल गणना actin-समृद्ध ruffling या protrusions .
  4. फोकल आसंजन विश्लेषण
    नोट: फोकल आसंजन विश्लेषण प्रदर्शन करने से पहले, फिजी के नवीनतम संस्करण पर मैक्सिकन Hat फ़िल्टर प्लगइन स्थापित करें. निम्नलिखित प्रोटोकॉल को पिछले अध्ययन19,20,21से संशोधित किया गया है .
    1. 19, हिस्टोग्राम डिब्बे 256, और 6 की एक अधिकतम ढलान का एक ब्लॉक आकार का उपयोग कर प्रक्रिया-एनहानस्थानीय कंट्रास्ट (Clahe) का चयन करें कोई मुखौटा और तेजी से नहीं के साथ। (चित्र 2C)
    2. प्रक्रिया-फिल्टर्स का चयन करें- छवि को फ़िल्टर करने के लिए 2.0 के सिग्मा (Radius) के साथ गाऊसी धुंधला (चित्र 2D) .
    3. 2.0 के त्रिज्या के साथ Plugins-मैक्सिकन Hat फ़िल्टर (Mhf) का चयन करें(चित्र 2E)।
    4. थ्रेशहोल्ड चलाएँ और थ्रेसहोल्ड विधि के रूप में Huang या Isodata का उपयोग करके डार्क बैकग्राउंड और ओवर/ स्वत: थ्रेशहोल्डका चयन करें.
      नोट: यह चरण आसंजन पर प्रकाश डाला है कि सुनिश्चित करता है, लेकिन यह भी एक दूसरे से अलग.
    5. निम्नलिखित चयनित मापदंडों के साथ विश्लेषण विश्लेषण कण का चयन करें: आकार $20, पिक्सल-इनफिनिटी और परिपत्र $0.00-0.99. सही पता लगाने और फोकल आसंजन के जुदाई सुनिश्चित करने के लिए रूपरेखा की जाँच करें.
      नोट: ये परिणाम संख्या, क्षेत्र, और आकार विवरण अलग-अलग फोकल आसंजन उपज।

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Representative Results

प्रयोगात्मक सेट-अप की एक सामान्य स्कीमा

चित्र 1 सेल आसंजन के लिए सामान्य स्कीमा का प्रतिनिधित्व करता है और REF52 कोशिकाओं के सीरम भुखमरी के साथ शुरुआत और अधिग्रहीत फ्लोरोसेंट छवियों की गणना विश्लेषण के साथ समाप्त होने वाले प्रोटोकॉल का प्रसार करता है। प्रोटोकॉल में मुख्य चरण समयरेखा में सचित्र हैं. नोट के चरण 2, प्रोटोकॉल के चरण 2 FN लेपित कवरलिप्स की तैयारी का वर्णन करता है, जो चरण 3 के साथ समवर्ती प्रदर्शन किया जाना चाहिए: सीरम भूख से मर REF52 कोशिकाओं उन्हें निलंबन में रखने से पहले (चित्र 1A)। एक नकली लेबल वाली 24-वेल प्लेट का एक उदाहरण जो उपचार समूहों और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए नमूनों के निर्धारण से पहले सेल आसंजन की अवधि को दर्शाता है (चित्र 1ख)।

फोकल आसंजन परिमाणीकरण के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि प्रसंस्करण

REF52 कोशिकाओं 90 मिनट के लिए निलंबन में आयोजित किया गया, FN पर चढ़ाया, और एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए पालन करने की अनुमति दी. निर्धारण और एक विरोधी paxillin एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने के बाद, फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट 8 बिट स्केल छवियों का अधिग्रहण किया गया. छवि संसाधन विश्लेषण चरण 5 में रेखांकित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था। दिखाया मूल छवि सहित प्रत्येक अलग प्रसंस्करण कदम के प्रतिनिधि छवियाँ हैं (चित्र 2A),और पृष्ठभूमि घटाव के बाद छवियों (पोस्ट रोलिंग गेंद) (चित्र 2B), CLAHE (चित्र 2C), गाऊसी धुंधला ( चित्र 2D) और मैक्सिकन Hat फ़िल्टर (पोस्ट-MHF) (चित्र 2E) फ़िल्टरिंग चरण. सभी छवि प्रसंस्करण चरणों को पूरा करने के बाद, व्यक्तिगत फोकल आसंजन प्रमुख होना चाहिए, ध्यान में, और आसानी से एक दूसरे से अलग (चित्र 2E). छवियों को फ़िल्टर करने के बाद, फोकल आसंजन मात्रा निर्धारित किया जा सकता है और उनके क्षेत्र मापा (कदम 5.1 और 5.4).

सेल आसंजन का दृश्य और ऑक्सीडेटिव तनाव के बाद FN पर फैल

एंटी-पैक्सिलिन (फोकल आसंजन मार्कर) की एक प्रतिनिधि ग्रेस्केल फ्लोरोसेंट छवि (चित्र 3, शीर्ष पैनल) और एलोलॉयडिन एफ-एक्टिन जांच दाग ( एफ 52 कोशिकाओं केचित्र 3, नीचे पैनल) के साथ या बिना Ku55933 पर चढ़ाना के बाद ( ROS-प्रेरित एजेंट) उपचार। परख से पहले, REF52 कोशिकाओं सीरम 1 एच के लिए भूखे थे. सीरम भुखमरी के बाद, कोशिकाओं को निलंबन में आयोजित किया गया, जबकि या तो अकेले वाहन या 10 डिग्री एम Ku55933 के साथ इलाज किया जा रहा ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरित करने के लिए. कोशिकाओं संकेत समय के लिए FN लेपित coverslips पर चढ़ाया गया, तय है, और फिर फोकल आसंजन और phaloidin के लिए एक एंटीबॉडी के साथ दाग एफ-actin प्रोटीन का पता लगाने के लिए. प्रमुख फोकल आसंजन और तनाव फाइबर एफ एफ एन पर 20-30 मिनट के लिए पालन करने की अनुमति दिए जाने के बाद REF52 कोशिकाओं में आसानी से दिखाई देना चाहिए। प्लेट्ड कोशिकाओं को आसंजन के बाद पूर्ण सेलुलर प्रसार की अनुमति देने के लिए एक दूसरे के साथ ओवरलैप नहीं करना चाहिए। स्पष्ट, विशिष्ट कक्ष किनारे के साथ-साथ अलग-अलग कोशिकाओं के प्रसार के लिए स्थान पर ध्यान दीजिए (चित्र 3)। कोशिका झिल्ली के अग्रणी किनारे पर एफ-एक्टिन समृद्ध झालर दिखाई देते हैं और एक तीर से इंगित किए जाते हैं (चित्र 3, नीचे पैनल)।

तनाव फाइबर की मात्रा निर्धारित फ्लोरोसेंट छवियों और सेल प्रसार की डिग्री की ग्राफिकल प्रतिनिधित्व

प्रतिबल फाइबर के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत और आसंजन के बाद विभिन्न समय पर Ku55933 उपचार के बिना फैल सेल की डिग्री का प्रतिनिधित्व बार ग्राफ के रूप में प्रदर्शित मात्रा छवियों के उदाहरण. चित्र 3में दिखाए गए चित्रों के समान,फेलॉयडिन एफ-एक्टिन जांच और एंटी-पैक्सिलिन धुंधला की फ्लोरोसेंट छवियों का विश्लेषण किया गया था, जो छवि विश्लेषण प्रक्रियाओं का उपयोग करके तनाव फाइबर और सेल फैलने के प्रतिशत के लिए विश्लेषण किया गया था (यानी, परिपत्र सूचकांक) प्रोटोकॉल के चरण 5 में वर्णित है. विशेष रूप से ऑक्सीडेंट उपचार के कारण सभी आसंजन समय बिंदुओं पर तनाव फाइबर निर्माण में उल्लेखनीय वृद्धि हुई (चित्र 4क) और सेल में कमी एफ एन के लिए सेल आसंजन के 15 मिनट के बाद फैल (चित्र 4B) .

संगम पर सेलुलर के कारण गैर-मात्रायोग्य इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों

सीरम भूखे REF52 कोशिकाओं 90 मिनट के लिए निलंबन में आयोजित किया गया, जिसके दौरान वे 10 $M Ku55933 के साथ इलाज किया गया ROS गठन प्रेरित करने के लिए. कोशिकाओं तो FN पर चढ़ाया गया और 20 मिनट के लिए पालन करने की अनुमति दी, जिसके बाद वे तय कर रहे थे और विरोधी paxillin या phaloidin-एलेक्सा 594 एफ-actin जांच के साथ दाग. उच्च कोशिका घनत्व पर चढ़ाना सेलुलर भीड़ की ओर जाता है, जो कोशिकाओं को अधिक संगम के कारण पूरी तरह से फैलने से रोकता है। सूचना कक्ष के किनारे सन्निकट कक्षों (पीले तीर)(चित्र 5क) से अविवेच्य होते हैं। नतीजतन, अलग-अलग कोशिकाओं का परिमाणीकरण निर्धारित किया गया है, और परिधि फैल सही ढंग से निर्धारित नहीं किया जा सकता है। चित्रा 5 बी में, एक अलग सेल लाइन, माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट्स (एमईएफ) को निलंबन में रखा गया था और फिर 30 मिनट के लिए एफएन पर चढ़ाया गया था। कोशिकाओं तो तय कर रहे थे और एक विरोधी paxillin एंटीबॉडी के साथ दाग. फोकस से बाहर कोशिकाओं को लाल तीरों द्वारा निरूपित किया जाता है (चित्र 5ठ) । इसके अलावा, सेलुलर मलबे के साथ विरोधी paxillin एंटीबॉडी के पार प्रतिक्रिया (नीले तीर) मात्रात्मक छवि विश्लेषण के दौरान दहलीज बदल जाएगा (भाग 5) और विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाना चाहिए (चित्र 5B).

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल की समय-रेखा और उदाहरण 24-वेल प्लेट सेट-अप।
(क)समय-रेखा सेल आसंजन और प्रसार प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरणों पर प्रकाश डालती है। (ख)प्रतिनिधि ने 24-प्लेट का लेबल लगाया, जिसमें सेल आसंजन के लिए उपचार समूहों और समय का चित्रण किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: छवि प्रसंस्करण के बाद प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसी छवियों के उदाहरण।
REF52 कोशिकाओं 90 मिनट के लिए निलंबन में आयोजित किया गया, FN पर चढ़ाया, और 15 मिनट के लिए पालन करने की अनुमति दी कोशिकाओं को तय किया गया और एक विरोधी paxillin एंटीबॉडी के साथ दाग. (A) मूल छवि और छवियों के बाद (बी) पृष्ठभूमि घटाव (पोस्ट रोलिंग बॉल ), (सी) CLAHE , (डी) गाऊसी धुंधला और (ई) मैक्सिकन टोपी फ़िल्टर (पोस्ट-MHF) छानने कदम. बार, 20 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विरोधी paxillin और phalloidin एफ-actin जांच के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसी छवियों FN पर चढ़ाया REF52 कोशिकाओं दाग.
परख से पहले, REF52 कोशिकाओं सीरम 1 एच के लिए भूखे थे. सीरम भुखमरी के बाद, कोशिकाओं को निलंबन में आयोजित किया गया, जबकि या तो अकेले वाहन या 10 डिग्री एम Ku55933 के साथ इलाज ऑक्सीडेटिव तनाव पैदा करने के लिए. कोशिकाओं को संकेत समय के लिए एफएन लेपित कवरलिप्स पर चढ़ाया गया था, एफ-एक्टिन प्रोटीन का पता लगाने के लिए फोकल आसंजन और एलोलॉयडिन के एंटीबॉडी के साथ स्थिर और दाग लगाया गया था। कोशिका झिल्ली के अग्रणी किनारे पर एफ-actin समृद्ध झालरों को तीर से दर्शाया जाता है। बार, 40 डिग्री मी. यह आंकड़ा Tolbert एट अल से संशोधित किया गया है5कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 4
चित्र 4: इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों का परिमाणीकरण।
रेखांकन (ए) तनाव फाइबर का प्रदर्शन कोशिकाओं का प्रतिशत और (बी) सेल परिपत्र माप. सेल परिपत्र को सेल परिधि से विभाजित कक्ष क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया था। मान 0-1.0 से लेकर क्रमशः एक लम्बी या गोल आकारिकी का संकेत देते हैं। त्रुटि सलाखों से संकेत मिलता है S.E.M. छात्र के t-परीक्षणयुग्मित नमूनों के लिए *p/lt;0.01 triplicate में किए गए प्रयोगों से. यह आंकड़ा Tolbert एट अल से संशोधित किया गया है5कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 5
चित्रा 5: गैर-मात्रायोग्य इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों।
(क)सीरम-भूखे REF52 कोशिकाओं को 90 मिनट के लिए निलंबन में रखा गया था, जबकि 10 डिग्री एम Ku55933 के साथ इलाज किया गया. कोशिकाओं को एफएन पर चढ़ाया गया था और 20 मिनट के लिए पालन करने की अनुमति दी गई थी। कोशिकाओं को स्थिर किया गया था और एंटी-पैक्सिलिन या एलेक्सा 594 एफ-एक्टिन जांच के साथ दाग दिया गया था। सेल किनारों पीले तीर द्वारा दिखाए जाते हैं। (बी) एमईएफ कोशिकाओं को निलंबित कर दिया गया और फिर 30 मिनट के लिए एफएन पर चढ़ाया गया। कोशिकाओं को स्थिर किया गया और एंटी-पैक्सिलिन एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया। फोकस कोशिकाओं में से लाल तीर द्वारा चिह्नित कर रहे हैं और सेलुलर मलबे के साथ विरोधी paxillin एंटीबॉडी के पार प्रतिक्रिया नीले तीर के साथ चिह्नित कर रहे हैं. बार, 30 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सेल प्रसार के दौरान गतिशील cytoskeleton remodeling के लिए तेजी से लंगर पर निर्भर सेल प्रकार के एक नंबर स्क्रीन करने के लिए एक बहुमुखी और किफायती तरीका है. विशेष रूप से, यह विधि मात्रात्मक रूप से ऑक्सीडेटिव दबाव के दौरान दबाव फाइबर और फोकस आसंजन गठन की जांच करती है जब कोशिकाएं एफ एन (चित्र 1क) का पालन करती हैं। इसके अलावा, ये सेलुलर फीनोटाइप्स छोटे जी.टी.पी.एस. के रो परिवार के सदस्यों के लिए एक विनियामक भूमिका का सुझाव दे सकते हैं क्योंकि उन्होंने सेल लगाव के दौरान भूमिकाओं का दस्तावेजीकरण किया है और15,16,22का प्रसार किया है . तथापि, जीटीपी-बाउंड, सक्रिय रो परिवार प्रोटीन की संभावित भागीदारी की पहचान करने के लिए अतिरिक्त जैव रासायनिक तकनीकों की आवश्यकता होगी।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल में एफ-एक्टिन और पैक्सिलिन का विशेष रूप से सेल आसंजन की जांच करने और एटीएम काइनेज अवरोध द्वारा प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव के बाद एफएन पर अमरीकृत फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के प्रसार की जांच करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसी का पता लगाया गया है (चित्र 2, चित्र 3 और चित्र 4) . हालांकि, इस प्रक्रिया को अन्य ईसीएम प्रोटीन और/या अन्य अनुलग्न सेल प्रकारों पर उपयोग के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। जब अन्य सेल लाइनों के लिए अनुकूल, यह प्रयोगात्मक स्थितियों का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से: सेल संख्या / घनत्व, सीरम भुखमरी के समय, ECM प्रोटीन एकाग्रता, और ऑक्सीडेटिव तनाव उपचार की स्थिति. आसंजन पर एक अज्ञात उत्तेजना के प्रभाव का परीक्षण और गतिशीलता के प्रसार करते समय, यह है कि परख सही ढंग से काम कर रहा है सत्यापित करने के लिए दोनों नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण नमूने शामिल करने के लिए आवश्यक है. नकारात्मक नियंत्रण नमूने एक अनुपचारित या वाहन केवल नमूना शामिल कर सकते हैं, जबकि एक सकारात्मक नियंत्रण ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरित करना चाहिए (जैसे, एच2हे2). इसके अलावा, हालांकि यहाँ चर्चा नहीं, यह भी उचित एंटीबॉडी नियंत्रण का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. यह सिफारिश की जाती है कि प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए तीन अलग - अलग नियंत्रणों का उपयोग इसकी विशिष्टता को सत्यापित करने और किसी भी संभावित फ्लोरोसेंट ब्लीड-थ्रू23,24की पहचान करने के लिए किया जाए . इनमें शामिल हैं: 1) एक प्राथमिक एंटीबॉडी नियंत्रण प्रतिजन के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी की विशिष्ट बाइंडिंग सुनिश्चित करने के लिए और पुष्टि करने के लिए कि प्रतिजन बाइंडिंग का उपयोग किया निर्धारण शर्तों के तहत होता है, 2) एक माध्यमिक एंटीबॉडी नियंत्रण (गैर-माध्यमिक संयुग्मी-एंटीबॉडी के लिए) ) कि प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए विशिष्टता से पता चलता है, और 3) फ्लोरोफोर नियंत्रण है कि यह सुनिश्चित फ्लोरोफोर जोड़ा अंतर्जात फ्लोरोसेंट या खून का परिणाम नहीं है के माध्यम से एक और एंटीबॉडी से.

हालांकि इस परख आसंजन विधानसभा और प्रसार की प्रारंभिक गतिज घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है, यह आसंजन disassembly या आसंजन शक्ति और सेलुलर सुदृढीकरण की विस्तृत परीक्षा के लिए उपयुक्त नहीं है. बाद लंबी अवधि इमेजिंग बायो स्टेशनों या एकल सेल बल स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक के उपयोग की आवश्यकता है. बाद की तकनीकों में परमाणु बल माइक्रोस्कोपी, ऑप्टिकल चिमटी, आसंजन प्रोटीन के तनाव सेंसर जैसे विन्कुलिन25 या टैलिन26,27,और 3 डी-बल माइक्रोस्कोपी28शामिल हैं।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम अच्छी तरह से कोटिंग FN के साथ coverss शामिल हैं. यह कोशिकाओं के समान प्रसार और आसंजन के लिए आवश्यक है। इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि इनक्यूबेशन से पहले कई बार कवरलिप्स पर एफएन समाधान को ऊपर और नीचे पिपेट किया जाए। कवरलिप्स ऊष्मायन समय के दौरान FN समाधान में पूरी तरह से जलमग्न रहना चाहिए। एफ एन लेपित कवरलिप्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है।

सेल घनत्व भी महत्वपूर्ण है, के रूप में कोशिकाओं है कि बहुत घनी चढ़ाया जाता है अधिकतम फैल परिधि को प्राप्त नहीं होगा. इसके अलावा, यह प्रत्येक व्यक्ति सेल के लिए व्यक्तिगत फोकल आसंजन या सेलुलर ruffles भेद करने के लिए संभव नहीं होगा. इसलिए, निलंबन में कोशिकाओं को रखने से पहले हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करना आवश्यक है। जबकि सेल घनत्व का एक अनुमान REF52 कोशिकाओं के लिए प्रदान की जाती है, यह अनुभवजन्य अध्ययन के तहत अन्य कोशिकाओं के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता होगी. कोशिकाओं को विरल रूप से इतना अधिक चढ़ाया जाना चाहिए कि कुछ कोशिकाएं ओवरलैप हो जाती हैं, जिससे वे पूरी तरह से फैल सकें (चित्र 5)।

प्रोटोकॉल में अन्य महत्वपूर्ण कदम पर विचार करने के लिए फ्लोरोसेंट संयुग्मी phaloidin-एलेक्सा 594 एफ-actin जांच और माध्यमिक एंटीबॉडी प्रकाश संवेदनशील हैं. इसलिए, नमूने न्यूनतम इन अभिकर्मकों के आवेदन के बाद प्रकाश के संपर्क में होना चाहिए. इसके अलावा, ऑक्सीडेटिव तनाव पैदा करने वाले कई एजेंटों में आधे जीवन कम होते हैं। इसलिए, यह पीक गतिविधि को प्राप्त करने के लिए इष्टतम खुराक और जोखिम समय के लिए चुने गए ऑक्सीडेंट का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है।

निम्नलिखित वर्गों के साथ मुसीबत शूटिंग युक्तियाँ शामिल FN एकाग्रता, सीरम भुखमरी की स्थिति, और सेल टुकड़ी के तरीके का संबंध है. इन युक्तियों उपयोगी होते हैं जब अन्य कोशिकाओं लाइनों और /

लगातार एफए विश्लेषण के लिए, इष्टतम लगाव और प्रसार की स्थिति आवश्यक है, जो ECM ligand के आधार पर अलग अलग होंगे. FN के लिए, 10-30g/mL की एक गतिशील श्रेणी का उपयोग शुरू करते हैं. FN के उच्च सांद्रता पर, वहाँ सेल लगाव में थोड़ा अंतर है. तथापि, कुछ सेल प्रकार कुशलतापूर्वक ECM के उच्च सांद्रता में फैल नहीं है.

प्रत्येक सेल प्रकार सीरम भुखमरी की स्थिति के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया करता है. REF52 कोशिकाओं को आसानी से व्यवहार्यता के किसी भी नुकसान के बिना रात भर भूखा किया जा सकता है, तथापि, यह सभी सेल लाइनों के लिए सच नहीं है. इसलिए, यह डिग्री जो अध्ययन के तहत सेल लाइन सीरम भुखमरी का सामना कर सकते हैं निर्धारित करने के लिए आवश्यक है.

परख के प्रसार के लिए, कोशिकाओं को reproduible परिणाम29के लिए संभव के रूप में कम समय के लिए trypsinized की जरूरत है. trypsinization द्वारा सेल टुकड़ी के बाद, सेल सतह रिसेप्टर्स, उनके cognate ligands, और Rho GTPasse गतिविधि स्थिर राज्य के स्तर पर लौटने के लिए एक वसूली अवधि की आवश्यकता14,15. इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित ट्रिप्सिनाइजेशन प्रक्रिया को कोशिकाओं को अपने अधिकांश कोशिका सतह FN-बाध्यकारी रिसेप्टर्स29को बनाए रखने में सक्षम होना चाहिए। हालांकि, कुछ सेल प्रकार सेल टुकड़ी के वैकल्पिक तरीकों की आवश्यकता के लिए पूरी तरह से सेल सतह रिसेप्टर्स के पाचन को रोकने के हो सकता है. इन विधियों में EDTA-आधारित समाधानों (उदा., Versene) या मामूली एंजाइमी वियोजन समाधान (उदा., Accutase) का उपयोग करके चेलेटिंग कक्ष शामिल हैं। इन वियोजन समाधानों का उपयोग सेल-सेल आसंजनों को अक्षुण्ण छोड़ सकता है जिसके परिणामस्वरूप सेल क्लंप हो सकते हैं। इसलिए यह पूरी तरह से व्यक्तिगत कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए प्रयोगात्मक reproducibility सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है.

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

लेखक ों की पांडुलिपि की समीक्षा के लिए डॉ स्कॉट आर हटन और मेघन एस ब्लैकलेज का धन्यवाद करते हैं। यह काम उच्च बिंदु विश्वविद्यालय के अनुसंधान और प्रायोजित कार्यक्रम (एमसीएस) और उत्तरी कैरोलिना राज्य विश्वविद्यालय (एमसीएस) में जैव प्रौद्योगिकी कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Gibco by Life Technologies 25300-054 cell dissociation
10 cm2 dishes Cell Treat 229620 sterile, tissue culture treated
15 mL conical tubes Fisher Scientific 05-539-5 sterile
1X Phosphate Buffered Saline Corning Cellgro 21-031-CV PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+
24-well cell culture treated plates Fisher Scientific 07-200-740 sterile, tissue culture treated
4°C refrigerator Fisher Scientific
Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) BD Transduction Laboratories 610620 marker of focal adhesions
Aspirator Argos EV310
Biosafety cabinet Nuair NU-477-400 Class II, Type A, series 5
Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder Fisher Scientific BP9704-100 dlBSA
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific BP231-100 organic solvent to dissolve Ku55933
Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose Fisher Scientific 11965092 REF52 base cell culture medium
Fetal bovine serum Fisher Scientific 16000044 certified, cell culture medium supplement
Fiji National Institutes of Health http://fiji.sc/ image analysis program
Filter syringe Fisher Scientific 6900-2502 0.2 µM, sterile
Glass coverslips (12-Cir-1.5) Fisher Scientific 12-545-81 autoclave in foil to sterilize
Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 fluorescent secondary antibody, light sensitive
Goat Serum Gibco by Life Technologies 16210-064 component of blocking solution for immunofluorescence
Hemocytometer Fisher Scientific 22-600-107 for cell counting
Human Plasma Fibronectin Gibco by Life Technologies 33016-015 FN
IX73 Fluorescence Inverted Microscope Olympus microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation
Ku55933 Sigma-Aldrich SML1109-25MG ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 cell culture medium supplement
Monochrome CMOS 16 bit camera Optimos
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G PFA, fixative for immunofluorescence
Penicillin-streptomycin Fisher Scientific 15-140-122 P/S, antibiotic solution for culture medium
Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) Invitrogen A12381 marker of F-actin, light sensitive
ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36941 cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive
REF52 cells Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018
Stir plate with heat control Corning Incorporated PC-420D
Syringe BD Biosciences 309653 60 mL syringe
Tissue culture incubator Nuair
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 detergent used to permeabilize cell membranes
Trypan Blue Solution Fisher Scientific 15-250-061 for cell counting
Trypsin Neutralizing Solution (1x) Gibco by Life Technologies R-002-100 TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum
tube rotator Fisher Scientific 11-676-341
water bath Fisher Scientific FSGPD02

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References

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  4. Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
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जैव रसायन अंक 152 सेल आसंजन सेलुलर प्रसार ऑक्सीडेटिव तनाव फाइब्रोनेक्टिन उपकला कोशिकाओं एटीएम अवरोध ruffles तनाव फाइबर सेल परिपत्र
ऑक्सीडेटिव तनाव के दौरान फाइब्रोनेक्टिन पर सेलुलर आडंशन की गतिशीलता और एपिथेलियल कोशिकाओं के प्रसार की जांच करना
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Tolbert, C. E., Palmquist, L.,… More

Tolbert, C. E., Palmquist, L., Dixon, H. L., Srougi, M. C. Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (152), e59989, doi:10.3791/59989 (2019).

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