En forbedret grøn fluorescens protein-baseret assay til at studere Neurite udvækst i primære neuroner

Summary

I denne rapport beskriver vi en simpel protokol til undersøgelse af neurit-vækst i embryonale rotte kortikale neuroner ved co-transftering med EGFP og det protein af interesse.

Abstract

Neurite udvækst er en fundamental begivenhed i dannelsen af neurale kredsløb under nervesystemet udvikling. Svær neurit skade og synaptisk dysfunktion forekommer i forskellige neurodegenerative sygdomme og aldersrelaterede degeneration. Undersøgelse af de mekanismer, der regulerer neurite udvækst ville ikke kun kaste værdifuldt lys på hjernens udviklingsmæssige processer, men også på sådanne neurologiske lidelser. På grund af den lave transfektering effektivitet, er det i øjeblikket udfordrende at studere virkningen af et specifikt protein på neurite udvækst i primære pattedyr neuroner. Her beskriver vi en simpel metode til undersøgelse af neurite udvækst ved co-transfection af primære rotte kortikale neuroner med EGFP og et protein af interesse (POI). Denne metode gør det muligt at identificere POI transficeret neuroner gennem egfp signal, og dermed virkningen af POI på neurite udvækst kan bestemmes præcist. Denne EGFP-baserede analyse giver en bekvem tilgang til undersøgelse af veje, der regulerer neurite outgrowth.

Introduction

Neurites, herunder både axoner og dendritter, er fremskrivninger fra neuroner, der er involveret i etableringen af neurale netværk. Den dynamiske udvækst af neuritter er afgørende for Neuro udvikling. De underliggende reguleringsmekanismer er dog stadig uklare. Især neurite skader er ofte observeret i forskellige neurodegenerative sygdomme og efter hjerneskader¹. Derfor, undersøgelse af rollerne af formodede molekyler i forskellige neurite udvækst regulerings veje ville forbedre vores forståelse af processen. Desuden, det kan afsløre nye terapeutiske mål for forskellige neurologiske lidelser. Neuronal cellelinjer er værdifulde modeller for at studere neuronal processer, herunder neurite udvækst, da de er nemme at manipulere og transficere^2,3. Imidlertid er genetisk afdrift blevet rapporteret at forekomme i nogle almindeligt anvendte cellelinjer, hvilket kan føre til variationer i deres fysiologiske respons⁴. Desuden er differential protein ekspression blevet vist mellem neuronal cellelinjer og primære neuroner. For eksempel, PC12, en neuronal cellelinje afledt af rotte binyrerne, der er almindeligt anvendt til at studere neurite udvækst^2,3, ikke udtrykker NMDA-receptorer⁵. Desuden er det blevet foreslået, at den reducerede reaktionsevne af muse neuroblastom linje Neuro-2A til neurotoksiner i forhold til primære neuroner skyldes den manglende ekspression af visse membranreceptorer og Ionkanaler⁶. Derfor, primære neuroner er en mere ønskelig og repræsentativ model for undersøgelse af neurite outgrowth. Men, brugen af primære neuroner hæmmes af deres lave transfektering effektivitet⁷.

Her beskriver vi en metode, der involverer Co-transfection af det protein af interesse (POI) og EGFP til primære rotte kortikale neuroner. Den egfp fungerer som en morfologiske markør for identifikation af vellykkede transficeret neuroner og tillader måling af neurites. Vi validerede denne metode ved hjælp af forbindelser/molekyler, der er blevet rapporteret at moduere neurite outgrowth. Desuden, FE65, et neuronal adapter protein, der har vist sig at stimulere neurite udvækst, blev brugt til at illustrere denne fremgangsmåde^8,9. Denne protokol indebærer (1) isolering af primære kortikale neuroner fra embryonale dag 18 (E18) rotte embryoner, (2) Co-transfection af neuroner med EGFP og POI (FE65 i dette studie) og (3) billeddannelse og analyse af neuroner ved hjælp af billedbehandling software ImageJ med NeuronJ plugin^10,11.

Protocol

Alle de fulgte procedurer var i overensstemmelse med de etiske standarder i dyreforsøg etiske komité for det kinesiske universitet i Hong Kong. 1. klargøring af Dæksedler Placer en steril 18 mm cirkulær dækseddel i hver brønd af en 12-brønd vævskultur plade. Coveret med 5 μg/mL poly-D-lysin opløsning i en befugret 37 °C inkubator i mindst 1 time. Aspirer poly-D-lysin opløsning fra vævskultur pladen og skyl de coatede dæksedler én gang med sterilt v…

Representative Results

For at teste denne metode, vi brugte cyto D og nerve vækstfaktor ngf, som har vist sig at hæmme og stimulere neurite udvækst henholdsvis14,15,16. Neurite-længden af neuroner, der blev transficeret med EGFP, blev målt efter behandling med cyto D eller NGF. Den transfektering effektivitet af egfp til neuroner var 2,7% (1.068 neuroner tælles). Som vist i figur 1<s…

Discussion

Som nævnt før, PC12 og dens subkloner er almindeligt ansat til at studere neurite udvidelse, fordi de har fremragende transfektering effektivitet^2,3. I modsætning hertil, primære neuroner har en lav transfektering sats, som er en stor hindring for at studere neurite udvækst regulatorer ved transfektering⁷. Her beskriver vi en bekvem protokol til kvantificering af neurite-udvækst i primære neuroner. På trods af den lave samlede tran…

Materials

#5 tweezers	Regine	5-COB
18 mm Circle Cover Slips	Thermo Scientific	CB00180RA	Sterilize before use.
B27 Supplement	Gibco	17504044
Cytochalasin D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolved in DMSO.
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Dissecting Scissors, 10 cm	World Precision Instruments	14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm	World Precision Instruments	15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fluorescence Mounting Medium	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein	Gibco	13257019
Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip	World Precision Instruments	504489
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Please see references 8 and 15
PBS Tablets	Gibco	18912014
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7280
Spatula	Sigma-Aldrich	S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061