Um ensaio com base em proteínas de fluorescência verde reforçada para estudar o crescimento do neurite em neurônios primários

Summary

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo simples para estudar o conseqüência do neurite em neurônios corticais do rato embrionário cotransfecting com EGFP e a proteína do interesse.

Abstract

O conseqüência do neurite é um evento fundamental na formação dos circuitos neural durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Dano de neurite severo e disfunção sináptica ocorrem em várias doenças neurodegenerativas e degeneração relacionada à idade. A investigação dos mecanismos que regulam o conseqüência do neurite não somente derramaria a luz valiosa em processos desenvolventes do cérebro mas igualmente em tais desordens neurológicas. Devido à baixa eficiência do transfection, é atualmente desafiante estudar o efeito de uma proteína específica no conseqüência do neurite em neurônios mamíferos preliminares. Aqui, nós descrevemos um método simples para a investigação do conseqüência do neurite pelo co-transfection de neurônios corticais do rato preliminar com EGFP e uma proteína do interesse (POI). Este método permite a identificação de neurônios transfected do POI através do sinal de EGFP, e assim o efeito do POI no conseqüência do neurite pode ser determinado precisamente. Este ensaio baseado em EGFP fornece uma aproximação conveniente para a investigação dos caminhos que regulam o outgrowth do neurite.

Introduction

Neurites, incluindo os axônios e dendritos, são as projeções de neurônios envolvidos no estabelecimento das redes neurais. O crescimento dinâmico dos neuritos é essencial para o neurodesenvolvimento. No entanto, os mecanismos regulamentares subjacentes permanecem pouco claros. Em particular, o dano de neurite é freqüentemente observado em várias doenças neurodegenerativas e após lesões cerebrais¹. Portanto, a investigação dos papéis de moléculas putativas em várias vias regulatórias de crescimento de neurite melhoraria nossa compreensão do processo. Além disso, pode revelar alvos terapêuticos novos para várias desordens neurológicas. As linhas celulares neuronais são modelos valiosos para estudar processos neuronais, incluindo o crescimento de neurite, pois são fáceis de manipular e transfecção^2,3. No entanto, a deriva genética tem sido relatada a ocorrer em algumas linhas celulares comumente usadas, o que pode levar a variações em suas respostas fisiológicas⁴. Além disso, a expressão diferencial da proteína foi mostrada entre linhas de pilha neuronal e neurônios preliminares. Por exemplo,^{PC12, uma}linha celular neuronal derivada da glândula adrenal do rato que é amplamente utilizada para estudar o conseqüência do neurite^{2,3, não}expressa receptores NMDA⁵. Além disso, tem sido proposto que a responsividade reduzida da linha neuro-2a neuroblastoma mouse para neurotoxinas em comparação com os neurônios primários é devido à falta de expressão de certos receptores de membrana e canais iônicos⁶. Conseqüentemente, os neurônios preliminares são um modelo mais desejável e representativo para a investigação do outgrowth do neurite. No entanto, o uso de neurônios primários é dificultado pela sua baixa eficiência de transfecção⁷.

Aqui, nós descrevemos um método que envolva o co-Transfection da proteína do interesse (POI) e do EGFP aos neurônios corticais principais do rato. O EGFP atua como um marcador morfológico para a identificação de neurônios transfectados com sucesso e permite a mensuração de neuritos. Nós validamos este método usando compostos/moléculas que foram relatadas para modular o outgrowth do neurite. Além disso, FE65, uma proteína do adaptador neuronal que seja mostrada para estimular o outgrowth do neurite, foi usada para ilustrar esta aproximação^8,9. Este protocolo envolve (1) o isolamento de neurônios corticais primários de embriões de ratos do dia embrionário 18 (E18), (2) a cotransfecção de neurônios com EGFP e o POI (FE65 neste estudo) e (3) a imagem e análise dos neurônios usando o processamento de imagens software ImageJ com o plugin NeuronJ^10,11.

Protocol

Todos os procedimentos seguidos estavam de acordo com os padrões éticos do Comitê de ética em experimentação animal da universidade chinesa de Hong Kong. 1. preparação de COVERSLIP Coloque uma lamínula circular estéril de 18 mm em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços. Cubra a lamínula com 5 μg/mL de solução de poli-D-lisina em uma incubadora humidificada de 37 ° c por pelo menos 1 h. Aspirar a solução de poli-D-lisina da placa…

Representative Results

Para testar essa metodologia, utilizou-se o fator NGF de crescimento do cito D e do nervo, que demonstrou inibir e estimular o crescimento doneurite, respectivamente,14,15,16. O comprimento do neurite dos neurônios transfected com EGFP foi medido após o tratamento com cyto D ou NGF. A eficiência do transfection de EGFP aos neurônios era 2,7% (1.068 neurônios contados). Como mostrado na <stro…

Discussion

Como afirmado antes, PC12 e seus subclones são amplamente empregados para estudar a extensão do neurite, pois têm excelente eficiência^detransfecção 2,3. Em contrapartida, os neurônios primários têm uma baixa taxa de transfecção, que é um grande obstáculo para o estudo dos reguladores de crescimento do neurite por transfecção⁷. Aqui, nós descrevemos um protocolo conveniente para quantificar o conseqüência do neurite em neu…

Materials

#5 tweezers	Regine	5-COB
18 mm Circle Cover Slips	Thermo Scientific	CB00180RA	Sterilize before use.
B27 Supplement	Gibco	17504044
Cytochalasin D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolved in DMSO.
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Dissecting Scissors, 10 cm	World Precision Instruments	14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm	World Precision Instruments	15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fluorescence Mounting Medium	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein	Gibco	13257019
Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip	World Precision Instruments	504489
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Please see references 8 and 15
PBS Tablets	Gibco	18912014
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7280
Spatula	Sigma-Aldrich	S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061