Ein verbesserter grüner Fluoreszenzprotein-basierter Assay zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchses in primärneuronen
Summary
In diesem Bericht beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Untersuchung des Neuritenauswüchss in embryonalen kortikalen Neuronen von Ratten durch Co-Transfecting mit EGFP und dem Protein von Interesse.
Abstract
Neuritenwachstum ist ein grundlegendes Ereignis bei der Bildung der neuronalen Schaltkreise während der Entwicklung des Nervensystems. Schwere Neuritenschäden und synaptische Dysfunktion treten bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen und altersbedingten Degeneration nen auf. Die Untersuchung der Mechanismen, die das Neuritenwachstum regulieren, würde nicht nur wertvolles Licht auf die Entwicklungsprozesse des Gehirns werfen, sondern auch auf solche neurologischen Störungen. Aufgrund der geringen Transfektionseffizienz ist es derzeit schwierig, die Wirkung eines bestimmten Proteins auf das Neuritenwachstum in primären Säugetierneuronen zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Untersuchung des Neuritenauswuchses durch die Kotransfektion von primären kortikalen Neuronen der Ersten Ratte mit EGFP und einem Protein von Interesse (POI). Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von POI transfizierten Neuronen über das EGFP-Signal, und so kann die Wirkung des POI auf das Neuritenwachstum genau bestimmt werden. Dieser EGFP-basierte Assay bietet einen bequemen Ansatz für die Untersuchung von Wegen zur Regulierung des Neuritenwachstums.
Introduction
Neurite, einschließlich Axone und Dendriten, sind die Projektionen von Neuronen, die an der Etablierung der neuronalen Netze beteiligt sind. Das dynamische Wachstum von Neuriten ist für die Neuroentwicklung unerlässlich. Die zugrunde liegenden Regulierungsmechanismen bleiben jedoch unklar. Insbesondere neuritäre Schäden werden oft bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen und nach Hirnverletzungen beobachtet1. Daher würde die Untersuchung der Rolle vermeintlicher Moleküle in verschiedenen neuriteren Auswuchs-Regulierungswegen unser Verständnis des Prozesses verbessern. Darüber hinaus kann es neue therapeutische Ziele für verschiedene neurologische Störungen offenbaren. Neuronale Zelllinien sind wertvolle Modelle für die Untersuchung neuronaler Prozesse einschließlich Neuritenwachstum, da sie leicht zu manipulieren und transfektsind 2,3. Es wurde jedoch berichtet, dass genetische Drift in einigen häufig verwendeten Zelllinien auftritt, was zu Variationen ihrer physiologischen Reaktionen führen könnte4. Darüber hinaus wurde eine differenzielle Proteinexpression zwischen neuronalen Zelllinien und primären Neuronen gezeigt. Zum Beispiel, PC12, eine neuronale Zelllinie aus Derbe rinder Nebennieren, die weit verbreitet für die Untersuchung von Neuritenauswachsen verwendet wird2,3, nicht ausdrücken NMDA-Rezeptoren5. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass die reduzierte Reaktionsfähigkeit der Maus Neuroblastom Linie Neuro-2a zu Neurotoxinen im Vergleich zu primären Neuronen ist aufgrund der mangelnden Expression bestimmter Membranrezeptoren und Ionenkanäle6. Daher sind primäre Neuronen ein wünschenswerteres und repräsentativeres Modell für die Untersuchung des Neuritenwachstums. Jedoch, die Verwendung von primären Neuronen wird durch ihre geringe Transfektion Effizienz behindert7.
Hier beschreiben wir eine Methode, die die Kotransfektion des Proteins von Interesse (POI) und EGFP in primäre kortikale Neuronen der Ratte beinhaltet. Das EGFP dient als morphologischer Marker zur Identifizierung erfolgreich transfizierter Neuronen und ermöglicht die Messung von Neuriten. Wir validierten diese Methode, indem wir Verbindungen/Moleküle verwendet haben, von denen berichtet wurde, dass sie das Neuritenwachstum modulieren. Darüber hinaus wurde FE65, ein neuronales Adapterprotein, das nachweislich das Neuritenwachstum stimuliert, verwendet, um diesen Ansatz zu veranschaulichen8,9. Dieses Protokoll beinhaltet (1) die Isolierung von primären kortikalen Neuronen von embryonalen Tag 18 (E18) Rattenembryonen, (2) die Kotransfektion von Neuronen mit EGFP und dem POI (FE65 in dieser Studie) und (3) die Bildgebung und Analyse der Neuronen mit Hilfe der Bildverarbeitung Software ImageJ mit dem NeuronJ Plugin10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie bereits erwähnt, PC12 und seine Subklonen sind weit verbreitet für das Studium der Neuritenerweiterung verwendet, weil sie ausgezeichnete Transfektionseffizienz2,3haben. Im Gegensatz dazu haben primäre Neuronen eine niedrige Transfektionsrate, was ein großes Hindernis für die Untersuchung von Neuriten-Auswuchsregulatoren durch Transfektion7darstellt. Hier beschreiben wir ein praktisches Protokoll zur Quantifizierung des Neuritenwa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel des Research Grants Council Hong Kong, health and Medical Research Fund (Hong Kong), CUHK Direct Grant Scheme, des United College Endowment Fund und des TUYF Charitable Trust unterstützt.
Materials
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO. |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
- Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
- Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
- Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
- Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
- Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
- Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
- Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
- Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
- Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
- He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
- Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)–soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
- Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
- Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).
- Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
- Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
- Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).
