Een verbeterde groene fluorescentie proteïne-gebaseerde assay voor het bestuderen van neuriet uitgroei in primaire neuronen
Summary
In dit rapport beschrijven we een eenvoudig protocol voor het bestuderen van neuriet uitgroei in embryonale rat corticale neuronen door co-transfecting met EGFP en het eiwit van belang.
Abstract
Neuriet uitgroei is een fundamenteel voorval in de vorming van de neurale circuits tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Ernstige neuriet schade en synaptische dysfunctie optreden in verschillende neurodegeneratieve ziekten en leeftijdsgebonden degeneratie. Onderzoek van de mechanismen die neuriet uitgroei reguleren zou niet alleen waardevolle licht werpen op de ontwikkeling van de hersenen processen, maar ook op dergelijke neurologische aandoeningen. Vanwege de lage transfectie-efficiëntie is het momenteel uitdagend om het effect van een specifiek eiwit op neuriet uitgroei in primaire zoogdieren neuronen te bestuderen. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het onderzoek naar neuriet uitgroei door de co-transfectie van primaire rat corticale neuronen met EGFP en een eiwit van belang (POI). Deze methode maakt de identificatie mogelijk van POI-getransfunde neuronen via het EGFP-signaal, en dus kan het effect van de POI op neuriet-uitgroei nauwkeurig worden bepaald. Deze EGFP-gebaseerde assay biedt een gemakkelijke aanpak voor het onderzoek van trajecten reguleren van neuriet uitgroei.
Introduction
Neurites, met inbegrip van zowel axonen en dendrites, zijn de projecties van neuronen die betrokken zijn bij de oprichting van de neurale netwerken. De dynamische uitgroei van neurites is essentieel voor neuro ontwikkeling. De onderliggende regelgevings mechanismen eronder blijven echter onduidelijk. In het bijzonder, neuriet schade wordt vaak waargenomen in verschillende neurodegeneratieve ziekten en na hersenletsel1. Daarom zou onderzoek naar de rollen van putatieve moleculen in verschillende neuriet uitgroei regelgevende trajecten ons begrip van het proces verbeteren. Bovendien, het kan onthullen nieuwe therapeutische doelen voor verschillende neurologische aandoeningen. Neuronale cellijnen zijn waardevolle modellen voor het bestuderen van neuronale processen met inbegrip van neuriet uitgroei als ze zijn gemakkelijk te manipuleren en transfect2,3. Echter, genetische drift is gemeld te voorkomen in sommige veelgebruikte cellijnen, die kunnen leiden tot variaties in hun fysiologische reacties4. Bovendien is differentiële eiwit expressie aangetoond tussen neuronale cellijnen en primaire neuronen. Bijvoorbeeld, PC12, een neuronale cellijn afgeleid van Rat bijnier die op grote schaal wordt gebruikt voor het bestuderen van neuriet uitgroei2,3, doet niet Express NMDA receptoren5. Bovendien is voorgesteld dat de verminderde responsiviteit van de muis neuroblastoom lijn neuro-2a naar neurotoxines in vergelijking met primaire neuronen is te wijten aan het gebrek aan expressie van bepaalde membraan receptoren en ionenkanalen6. Daarom, primaire neuronen zijn een meer wenselijk en representatief model voor het onderzoek van neuriet uitgroei. Echter, het gebruik van primaire neuronen wordt belemmerd door hun lage transfectie-efficiëntie7.
Hier beschrijven we een methode waarbij de co-transfectie van het eiwit van belang (POI) en EGFP aan primaire rat corticale neuronen. De EGFP fungeert als een morfologische marker voor de identificatie van succesvol getransfunde neuronen en maakt de meting van neurites mogelijk. We gevalideerd deze methode met behulp van verbindingen/moleculen die zijn gemeld aan het moduleren van neuriet uitgroei. Bovendien, FE65, een neuronale adapter eiwit dat is aangetoond dat het stimuleren van neuriet uitgroei, werd gebruikt ter illustratie van deze aanpak8,9. Dit protocol omvat (1) de isolatie van primaire corticale neuronen van embryonale dag 18 (E18) Rat embryo’s, (2) de co-transfectie van neuronen met EGFP en de POI (FE65 in deze studie) en (3) de beeldvorming en analyse van de neuronen met behulp van de beeldverwerking software ImageJ met de NeuronJ plugin10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoals eerder vermeld, PC12 en de subclones worden op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van neurite uitbreiding omdat ze uitstekende transfectie efficiëntie2,3. In tegenstelling, primaire neuronen hebben een lage transfectie tarief, dat is een groot obstakel voor het bestuderen van neuriet uitgroei regulators door transfectie7. Hier beschrijven we een handig protocol voor het kwantificeren van neuriet uitgroei in primaire neuronen….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door fondsen van de Raad voor onderzoeksbeurzen Hong Kong, Health and Medical Research Fund (Hong Kong), cuhk direct subsidie Scheme, het United College begiftiging Fund en de tuyf liefdadigheid Trust.
Materials
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO. |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
- Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
- Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
- Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
- Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
- Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
- Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
- Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
- Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
- Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
- He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
- Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)–soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
- Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
- Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).
- Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
- Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
- Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).
