Summary
Dans ce rapport, nous décrivons un protocole simple pour étudier la croissance neurite dans les neurones corticaux embryonnaires de rat en co-transfectant avec l'EGFP et la protéine d'intérêt.
Abstract
La croissance neurite est un événement fondamental dans la formation des circuits neuronaux pendant le développement du système nerveux. Les dommages graves de neurite et le dysfonctionnement synaptique se produisent dans diverses maladies neurodegenerative et dégénérescence relative à l'âge. L'étude des mécanismes qui règlent la croissance de neurite jetterait non seulement la lumière valable sur des processus développementals de cerveau mais également sur de tels désordres neurologiques. En raison de la faible efficacité de transfection, il est actuellement difficile d'étudier l'effet d'une protéine spécifique sur la croissance neurite chez les neurones mammifères primaires. Ici, nous décrivons une méthode simple pour l'étude de la croissance de neurite par la co-transfection des neurones corticaux primaires de rat avec EGFP et une protéine d'intérêt (POI). Cette méthode permet d'identifier les neurones transfectés POI par le signal EGFP, et ainsi l'effet de l'IPI sur la croissance neurite peut être déterminé avec précision. Cet exemple d'EGFP fournit une approche pratique pour l'étude des voies régulant la croissance neurite.
Introduction
Les neurites, y compris les axones et les dendrites, sont les projections des neurones impliqués dans l'établissement des réseaux neuronaux. La croissance dynamique des neurites est essentielle au neurodéveloppement. Cependant, les mécanismes de réglementation sous-jacents restent flous. En particulier, des dommages de neurite sont souvent observés dans diverses maladies neurodegenerative et après des dommages de cerveau1. Par conséquent, l'étude des rôles des molécules putatives dans diverses voies réglementaires de croissance neurite améliorerait notre compréhension du processus. En outre, il peut révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour divers désordres neurologiques. Les lignées cellulaires neuronales sont des modèles précieux pour l'étude des processus neuronaux, y compris la croissance neurite car ils sont faciles à manipuler et transfect2,3. Cependant, la dérive génétique a été rapportée pour se produire dans quelques lignées de cellules couramment utilisées, qui pourraient mener aux variations dans leurs réponses physiologiques4. En outre, l'expression différentielle de protéine a été montrée entre des lignes neuronales de cellules et des neurones primaires. Par exemple, PC12, une lignée cellulaire neuronale dérivée de la glande surrénale rat qui est largement utilisé pour étudier la croissance neurite2,3, n'exprime pas les récepteurs NMDA5. En outre, il a été proposé que la réactivité réduite de la ligne de neuroblastome de souris neuro-2a aux neurotoxines par rapport aux neurones primaires est due au manque d'expression de certains récepteurs de membrane et canaux d'ion6. Par conséquent, les neurones primaires sont un modèle plus souhaitable et représentatif pour l'étude de la croissance neurite. Cependant, l'utilisation des neurones primaires est entravée par leur faible efficacité de transfection7.
Ici, nous décrivons une méthode qui implique la co-transfection de la protéine d'intérêt (POI) et de l'EGFP aux neurones corticaux primaires de rat. L'EGFP agit comme un marqueur morphologique pour l'identification des neurones transfectés avec succès et permet de mesurer les neurites. Nous avons validé cette méthode en utilisant des composés/molécules qui ont été rapportés pour moduler la croissance de neurite. En outre, FE65, une protéine adaptatrice neuronale qui a été montrée pour stimuler la croissance neurite, a été employée pour illustrer cette approche8,9. Ce protocole implique (1) l'isolement des neurones corticaux primaires des embryons embryonnaires de rat 18 (E18), (2) la co-transfection des neurones avec EGFP et le POI (FE65 dans cette étude) et (3) l'imagerie et l'analyse des neurones en utilisant le traitement de l'image logiciel ImageJ avec le plugin NeuronJ10,11.
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Protocol
Toutes les procédures suivies étaient conformes aux normes éthiques du comité d'éthique de l'expérimentation animale de l'Université chinoise de Hong Kong.
1. Préparation des fiches de couverture
- Placez un bordereau circulaire stérile de 18 mm dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire de 12 puits.
- Enrober la couverture d'une solution poly-Lysine de 5 g/mL dans un incubateur humidifié de 37 oC pendant au moins 1 h.
- Aspirez la solution poly-D-lysine de la plaque de culture tissulaire et rincez les couvertures enduites une fois avec de l'eau stérile.
2. Dissection embryonnaire de neurone de rat
- Sacrifiez un rat Sprague-Dawley au moment où il est enceinte à l'âge gestationnel de 18 jours (E18) par luxation cervicale ou asphyxie au CO2.
REMARQUE: S'il vous plaît vérifier les règlements locaux pour le sacrifice des rats enceintes. - Ouvrez la cavité abdominale du rat enceinte avec des ciseaux disséquants et transférez l'utérus dans un plat Petri de 10 cm.
- Ouvrez soigneusement l'utérus et le sac amniotique avec de petits ciseaux disséquants et retirez le placenta de l'embryon de rat à l'aide de petits ciseaux disséquants. Transférer l'embryon entier dans un plat Petri de 10 cm avec du phosphate tamponné préréfrigéré, complété par du glucose (PBS-glucose, 10 mM de phosphates de sodium, 2,68 mM de chlorure de potassium, 140 mm de chlorure de sodium et 3 g/L de glucose) à l'aide d'une paire de petits forceps.
- Couper le long de la suture sagittale du crâne et l'ouvrir soigneusement avec une paire de petits ciseaux disséquants. Transférer le cerveau embryonnaire à l'eau avec une petite spatule plate dans un plat Petri de 10 cm avec du PBS-glucose glacé.
- Séparez les deux hémisphères cérébraux du cervelet et du tronc cérébral à l'aide de deux pinces #5 sous un microscope à dissection.
REMARQUE: Veuillez consulter la référence12 pour la structure du cerveau du rat. - Retirer les méninges à l'aide de la pince à épiler #5.
- Isolez le cortex des hémisphères cérébraux avec deux pinces #5 droites.
- Transférer le cortex isolé au PBS-glucose glacé dans un tube centrifugeur de 15 ml.
3. Culture primaire de neurones corticales
REMARQUE: Toutes les procédures aux étapes 3 et 4 sont effectuées à l'intérieur d'un coffret de biosécurité de classe II.
- Régler le cortex isolé par gravité à 4 oC pendant 5 min et aspirer le PBS-glucose.
- Ajouter 1 ml de 0,05 % de trypsine-EDTA au cortex isolé et mélanger délicatement en tapant et incuber le tissu dans un bain d'eau de 37 oC pendant 10 min pour permettre une digestion enzymatique. Appuyez doucement sur le tube pour mélanger toutes les 2 minutes.
- Ajouter 4 ml de milieu d'entretien (p. ex., Neurobasal Medium) au mélange tissu/trypsine.
REMARQUE: Tout le support d'entretien utilisé dans ce protocole est complété par la pénicilline-Streptomycine et B-27 supplément13. - Dissocier doucement le tissu par trituration à l'aide d'une pipette de 1 ml.
- Pelleter les cellules dissociées par centrifugation à 200 x g pendant 5 min. Aspirez le supernatant.
- Répétez les étapes 3,5 à 3,7 deux fois.
- Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de milieu d'entretien.
- Ajouter 10 L de 0,4% de solution Trypan Blue à 10 l de suspension cellulaire pour le comptage des cellules viables par un hémocytomètre.
- Plaquer les neurones à une densité de 65 000/cm2 (cellules viables) dans 1 ml de milieu d'entretien par puits dans une plaque de 12 puits.
4. Transfection et fixation cellulaires
- À 2 jours in vitro (DIV2), transfect 0.5 'g de la construction d'EGFP (pEGFP-C1) aux neurones ensemble avec ou sans de 0.5 'g de POI en utilisant 1 'L de réactif de transfection (par exemple, Lipofectamine 2000). Utilisez les instructions du fabricant.
REMARQUE: Des constructions d'expression de mammifères ont été préparées en utilisant un kit libre de préparation de plasmide d'endotoxine. Le traitement avec des produits chimiques/molécules (dans ce manuscrit cytochalasin D (Cyto D) et facteur de croissance de nerf (NGF) ont été employés) peut être fait à 6 h après transfection. - Aspirer le milieu de culture 24 h après la transfection et laver les cellules transfectées une fois avec 37 OC de PBS (10 mM de phosphates de sodium, 2,68 mM de chlorure de potassium, 140 mM de chlorure de sodium).
- Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde en PBS pendant 10 min dans l'obscurité à température ambiante.
- Laver les cellules fixes trois fois avec DU PBS.
- Ajouter un minimum de milieu de montage de fluorescence sur une lame de verre de microscope. Transférer délicatement la plaque de couverture de la plaque de 12 puits sur le support de montage avec l'échantillon face à la glissière de verre.
REMARQUE: Scellez le bord de la glissière avec du vernis à ongles si un milieu de montage aqueux est utilisé.
5. Mesure de la croissance neurite
- Utilisez un objectif 40x pour capturer des images à l'aide d'un microscope épifluorescent.
- Capturez des images d'au moins 40 neurones intacts avec le signal EGFP par transfection.
- Ouvrez l'image capturée dans le logiciel ImageJ avec le plugin NeuronJ11 pour mesurer la longueur de la plus longue neurite, du corps cellulaire à la pointe du cône de croissance, de chaque neurone image.
- Analyser les données obtenues avec le logiciel pour déterminer l'effet des protéines ciblées dans la croissance neurite.
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Representative Results
Pour tester cette méthodologie, nous avons utilisé Cyto D et facteur de croissance nerveuse NGF, qui ont été montrés pour inhiber et stimuler la croissance neurite respectivement14,15,16. La longueur neurite des neurones transfectés avec EGFP ont été mesurées après traitement avec Cyto D ou NGF. L'efficacité de transfection de l'EGFP aux neurones était de 2,7 % (1 068 neurones comptés). Comme le montre la figure 1A, Cyto D a supprimé l'extension de neurite d'une manière dépendante de la dose. Inversement, la croissance neurite a été potentialisée dans les neurones traités par NGF (Figure 1B).
Ensuite, nous avons étudié l'utilité de ce système en transfectant l'adaptateur neuronal FE65, qui a été montré pour promouvoir la croissance neurite. Les neurones corticaux primaires de rat ont été co-transfected avec FE65 et EGFP. Malgré la faible efficacité de transfection, l'analyse d'immunofluorescence a révélé que plus de 80 % des neurones ont été co-transfectés avec EGFP et FE65(figure 2A). Semblable aux rapports précédents8,9, FE65 a considérablement stimulé la croissance neurite par 2x (Figure 2B). Nous avons également analysé l'expression de l'EGFP et fe65 à différents moments par l'analyse western blot. Comme le montre la figure 2C, l'EGFP et la FE65 ont été détectés respectivement 6 h et 12 h après la transfection. Des niveaux d'expression semblables des protéines ont été observés dans 1 d à 7 neurones de poteau-transfection de d. Ceci indique que l'analyse de la croissance neurite pourrait être faite dès 6 h après la transfection ou dans des neurones plus matures. Ensemble, ces données suggèrent que le protocole mentionné est approprié pour déterminer le rôle des protéines réglementaires de croissance de neurite putative par transfection classique.
Nous avons également surveillé l'effet de la posologie de gène sur la croissance de neurite en transfectant les neurones corticaux primaires de rat avec différentes quantités de l'ADN plasmide de FE65. Comme le montre la figure 2D, on a observé une augmentation de l'extension de la neurite dépendante de la dose de 0 à 0,5 g d'ADN plasmide FE65. Cependant, il n'y avait pas de différence significative entre les neurones transfectés avec 0,5 g ou 1 g d'ADN plasmide (Figure 2D).
Figure 1 : Cyto D et NGF modulés par Cyto D et NGF. Les neurones corticaux de rat D18 ont été transfectés sur DIV2 avec un vecteur d'expression d'EGFP. 6 h après la transfection, les cellules ont été traitées avec (A) 0-0.5 'g/mL Cyto D ou (B) 0-100 ng/mL NGF pendant 24 h. Ensuite, les neurones ont été fixés et imaged en conséquence. Les images ont été capturées avec l'objectif 40x utilisant un microscope d'épifluorescence et la longueur du plus long neurite du corps cellulaire à la pointe du cône de croissance a été mesurée en utilisant ImageJ avec le plugin de NeuronJ. Trois expériences indépendantes ont été exécutées et au moins 40 neurones ont été mesurés dans chaque groupe. Le graphique à barres a montré le changement de pli dans la longueur moyenne de neurite. Un test t-apparié a été adopté pour l'analyse statistique. p 'lt; 0.001, 'p 'lt; 0.05. Barres d'erreur - S.E.M. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : FE65 stimule la croissance des neurites. Les neurones corticaux de rat D18 ont été transfectés sur DIV2 avec la commande de vecteur vide (EV) ou FE65 avec un vecteur d'expression d'EGFP. Les cellules ont été fixées et imaged 24 h après transfection. (A) Les neurones transfectés ont été contrecarrés avec l'anticorps anti-FE65 et le nombre de cellules avec EGFP ou FE65 individuellement transfecté et EGFP - FE65 co-transfected ont été comptés. Trois expériences indépendantes ont été réalisées et au moins 100 cellules ont été comptées dans chaque expérience. Les données ont été exprimées comme le pourcentage de cellules avec des signaux EGFP et EGFP FE65. lt; 0,001. Barres d'erreur - S.D. (B) La longueur de la plus longue neurite du corps cellulaire à la pointe du cône de croissance a été mesurée à l'aide d'ImageJ avec le plugin NeuronJ. Des images représentatives de neurone ont été montrées dans le panneau droit. FE65 a été taché par un anticorps anti-FE65 de chèvre comme décrit8,17. Trois expériences indépendantes ont été exécutées et au moins 40 neurones ont été mesurés par transfection. Le graphique à barres a montré le changement de pli dans la longueur moyenne de neurite. Les données ont été analysées par un test non apparié. lt; 0,001. Barres d'erreur ' S.E.M. Barre d'échelle '10 'm. (C) Analyse de tache occidentale de l'expression des niveaux de EGFP et FE65 aux points de temps post-transfection comme indiqué. EGFP et FE65 ont été détectés par la souris anti-GFP et anti-myc (à FE65 C-terminal myc tag), respectivement. (D) La longueur moyenne de neurite des neurones transfectés avec diverses quantités d'ADN plasmide FE65 comme indiqué. Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de tests ANOVA à sens unique avec le test post-hoc Bonferroni. p 'lt; 0.001, 'p 'lt; 0.05. Barres d'erreur ' S.E.M. Barre d'échelle '10 'm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Comme indiqué précédemment, PC12 et ses sous-clones sont largement utilisés pour étudier l'extension de neurite parce qu'ils ont une excellente efficacité de transfection2,3. En revanche, les neurones primaires ont un faible taux de transfection, qui est un obstacle majeur pour l'étude des régulateurs de croissance neurite par transfection7. Ici, nous décrivons un protocole commode pour quantifier la croissance de neurite dans les neurones primaires. Malgré la faible efficacité globale de transfection, plus de 80 % des neurones transfectés ont été co-transfectés avec succès avec les deux protéines : FE65 et EGFP (Figure 2A). Par conséquent, en analysant les neurones étiquetés EGFP, l'effet de FE65 sur la croissance neurite pourrait être déterminé avec précision (Figure 2B).
Un autre avantage de l'approche basée sur l'EGFP décrit est que la coloration d'immunofluorescence peut être omise. La coloration d'immunofluorescence de Tuj 1, une classe spécifique au neurone III , est largement utilisée comme marqueur morphologique lors de l'étude de l'allongement de la neurite18,19,20,21. En plus de Tuj 1, la coloration du POI est nécessaire pour l'identification des neurones transfectés19,22,23. On sait que la consistance de la coloration de l'immunofluorescence, qui est cruciale pour la mesure de la croissance de la neurite, est affectée par de nombreux facteurs, y compris la préparation de l'échantillon et les anticorps24. Par conséquent, la simplicité globale de la méthode basée sur l'EGFP pourrait améliorer la précision de l'analyse.
Dans notre protocole, les neurones sont fixés pour la mesure de neurite 24 h post-transfection. Ainsi, les neurones sont exposés au réactif de transfection pendant 24 h. Il est connu depuis longtemps que les réactifs de transfection sont toxiques pour les cellules25. Si l'effet de l'iLE sur l'extension de neurite doit être déterminé au-delà de DIV3, le réapprovisionnement moyen frais peut aider à réduire au minimum la toxicité. En outre, d'autres méthodes d'administration de gènes peuvent être envisagées telles que la co-précipitation et la nucléoféction du phosphate Ca2, qui ont toutes deux un effet moins toxique sur les cellules26. En outre, nous montrons ici que l'effet le plus élevé de FE65 sur la croissance neurite est observé dans les neurones transfectés avec ce 0,5 g de FE65 et 0,5 g de plasmides EGFP en utilisant 1 L de réactif de transfection. Pour les autres POI, les quantités optimales d'ADN plasmide et de réactifs de transfection doivent être déterminées car les protéines ont des taux de rotation très différents.
En plus de la méthode de livraison de gènes, la densité cellulaire est un autre paramètre critique à considérer. Si la densité des neurones est trop élevée, il devient difficile d'identifier les origines des neurites car elles se chevauchent les unes avec les autres. Bien que les cellules de placage à une faible densité puissent résoudre le problème, la survie des neurones primaires serait considérablement réduite à une faible densité cellulaire27. Les neurones hippocampaux primaires de rat se sont avérés se développer sainement à la densité entre 40.000 à 100.000/cm2 28. Dans ce protocole, une densité de 65 000/cm2 de neurones corticaux de rat est utilisée. Néanmoins, il est important de déterminer la densité cellulaire appropriée pour différents types de neurones dans différentes conditions expérimentales.
La mesure neurite des neurones primaires de rat en développement (c.-à-d. neurones dIV3) est décrite ici. Cependant, des phénotypes neuronaux plus matures peuvent être observés dans les neurones au-delà de DIV329. Comme les effets des POI ou des médicaments sur l'extension de la neurite dans les neurones matures peuvent être différents des neurones en développement, l'enquête en utilisant des neurones de différents stades fournirait une perspective plus complète. Il est à noter que nous étions encore en mesure d'observer l'expression EGFP dans les neurones 7 d post-transfection. Cela peut faciliter l'étude des POI ou des médicaments sur la croissance neurite dans les neurones matures.
Les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) sont des outils précieux pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques. Par exemple, l'étude de la croissance neurite dans ces cellules pourrait révéler de nouvelles cibles dans la neurorégénération que l'utilisation de neurones dérivés de hiPSC évite les différences d'espèces. Semblable aux neurones primaires de rongeur, les neurones hiPSC-dérivés sont difficiles à transfect30,qui peuvent réduire l'efficacité de co-transfection de l'EGFP et du POI. Par conséquent, l'utilisation de vecteurs d'expression polycistroniques mammifères pourrait garantir que toutes les cellules transfectées expriment l'ensemble des gènes transfectés, y compris l'EGFP et les POI. En outre, d'autres méthodes d'administration de gènes, telles que l'électroporation, peuvent améliorer l'efficacité de la transfection. Encore une fois, la viabilité cellulaire est une question qui doit être prise en considération lors de l'utilisation de telles approches de livraison de gènes.
On sait que le cortex cérébral embryonnaire des rats contient différents types de neurones, y compris les neurones stellates épineux, les neurones bipolaires et les neurones à long projet31. Bien que ce protocole énoncé ici puisse révéler l'effet général des POI sur la croissance neurite, il est possible que le même POI puisse présenter des réponses différentes dans différents types de neurones. Par exemple, la myostatine augmente le nombre d'axones sensoriels mais pas celui des axones moteurs32. Dans un tel scénario, la modification du protocole est nécessaire, comme l'isolement préalable de certains types de neurones par cytométrie de flux. Alternativement, des anticorps neuronaux spécifiques de marqueur peuvent être employés pour identifier les types exigés de neurones pendant l'imagerie.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun conflit d'intérêts avec le contenu de cet article.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des fonds du Research Grants Council Hong Kong, du Health and Medical Research Fund (Hong Kong), du programme de subventions directes de la CUHK, du fonds de dotation du United College et du TUYF Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
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