En förbättrad grön fluorescens proteinbaserad test för att studera Neurite utväxt i primära nervceller

Summary

I denna rapport beskriver vi ett enkelt protokoll för att studera påverkar utväxt i embryonala råtta kortikala neuroner genom Co-transfecting med egfp och proteinet av intresse.

Abstract

Neurite utväxt är en grundläggande händelse i bildandet av neurala kretsar under nervsystemets utveckling. Svår neurit skador och synaptisk dysfunktion förekommer i olika neurodegenerativa sjukdomar och åldersrelaterade degeneration. Utredning av de mekanismer som reglerar påverkar utväxt skulle inte bara kasta värdefullt ljus över hjärnans utvecklingsprocesser utan också på sådana neurologiska sjukdomar. På grund av den låga transfektion effektivitet, det är för närvarande utmanande att studera effekten av ett specifikt protein på neurit utväxt i primära däggdjurs nervceller. Här beskriver vi en enkel metod för utredning av påverkar utväxt av co-transfektion av primära råtta kortikala neuroner med egfp och ett protein av intresse (POI). Denna metod gör det möjligt att identifiera POI transfekterade nervceller genom egfp signalen, och därmed effekten av POI på påverkar utväxt kan bestämmas exakt. Denna egfp-baserade analysen ger en bekväm metod för utredning av vägar som reglerar påverkar utväxt.

Introduction

Neuriter, inklusive både axoner och dendriter, är projektionerna från nervceller inblandade i inrättandet av neurala nätverk. Den dynamiska utväxten av neuriter är avgörande för neuroutveckling. De bakomliggande regleringsmekanismerna under förblir dock oklara. I synnerhet, neurit skador observeras ofta i olika neurodegenerativa sjukdomar och efter hjärnskador¹. Därför, utredning av roller av förmodade molekyler i olika påverkar utväxt reglerings vägar skulle förbättra vår förståelse av processen. Dessutom kan det avslöja nya terapeutiska mål för olika neurologiska sjukdomar. Neuronala cellinjer är värdefulla modeller för att studera neuronala processer inklusive påverkar utväxt eftersom de är lätta att manipulera och transfect^2,3. Emellertid, genetisk drift har rapporterats förekomma i vissa vanligen använda cellinjer, vilket kan leda till variationer i deras fysiologiska svar⁴. Dessutom, Differentiellt proteinuttryck har visats mellan neuronala cellinjer och primära nervceller. Till exempel, PC12, en neuronala cellinjer härrör från råtta binjurar som ofta används för att studera neurit utväxt^2,3, inte uttrycker NMDA-receptorer⁵. Dessutom har det föreslagits att den minskade lyhördhet mus neuroblastom linje neuro-2A till neurotoxiner i jämförelse med primära nervceller beror på avsaknaden av uttryck för vissa membran receptorer och jonkanaler⁶. Därför, primära nervceller är en mer önskvärd och representativ modell för utredning av neurit utväxt. Emellertid, användningen av primära nervceller hindras av deras låga transfektion effektivitet⁷.

Här beskriver vi en metod som involverar Co-transfektion av proteinet av intresse (POI) och EGFP till primär råtta kortikala neuroner. Egfp fungerar som en morfologisk markör för identifiering av framgångsrikt transfekterade nervceller och tillåter mätning av neuriter. Vi validerade denna metod genom att använda föreningar/molekyler som har rapporterats att modulera påverkar utväxt. Dessutom, FE65, en neuronala adapter protein som har visat sig stimulera påverkar utväxt, användes för att illustrera detta tillvägagångssätt^8,9. Detta protokoll innebär (1) isolering av primära kortikala neuroner från embryonala dag 18 (E18) råtta embryon, (2) Co-transfektion av nervceller med EGFP och POI (FE65 i denna studie) och (3) avbildning och analys av nervceller med hjälp av bildbehandling programvara ImageJ med NeuronJ plugin^10,11.

Protocol

Alla tillvägagångssätt följde var i överensstämmelse med de etiska standarderna av den djura experimenterande etikkommittén av det kinesiska universitetar av Hong Kong. 1. beredning av täckglas Placera en steril 18 mm cirkulär täckslip i varje brunn av en 12-och vävnadsodling plattan. Täck täckslip med 5 μg/mL Poly-D-lysin lösning i en fuktad 37 ° c inkubator i minst 1 h. Aspirera Poly-D-lysin lösning från vävnaden kultur plattan och skölj de b…

Representative Results

För att testa denna metod, vi använde CYTO D och nervtillväxtfaktor NGF, som har visat sig hämma och stimulera neurit utväxt respektive14,15,16. Neuritlängden av neuroner som transfekterade med egfp mättes efter behandling med CYTO D eller NGF. Den transfektion effektivitet EGFP till nervceller var 2,7% (1 068 nervceller räknas). Som visas i figur 1A<…

Discussion

Som nämnts tidigare, PC12 och dess subkloner är allmänt anställda för att studera påverkar förlängning eftersom de har utmärkta transfektion effektivitet^2,3. I motsats, primära nervceller har en låg transfektion hastighet, vilket är ett stort hinder för att studera påverkar utväxt regulatorer genom transfektion⁷. Här beskriver vi ett bekvämt protokoll för att kvantifiera påverkar utväxt i primära nervceller. Trots den …

Materials

#5 tweezers	Regine	5-COB
18 mm Circle Cover Slips	Thermo Scientific	CB00180RA	Sterilize before use.
B27 Supplement	Gibco	17504044
Cytochalasin D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolved in DMSO.
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Dissecting Scissors, 10 cm	World Precision Instruments	14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm	World Precision Instruments	15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fluorescence Mounting Medium	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein	Gibco	13257019
Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip	World Precision Instruments	504489
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Please see references 8 and 15
PBS Tablets	Gibco	18912014
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7280
Spatula	Sigma-Aldrich	S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061