Un saggio basato sulle proteine con fluorescenza verde potenziato per studiare la crescita neurite nei neuroni primari
Summary
In questa relazione, descriviamo un semplice protocollo per studiare la escrescenza di neurite nei neuroni corticali embrionali del ratto co-traducendo con EGFP e la proteina di interesse.
Abstract
L’escrescenza di Neurite è un evento fondamentale nella formazione dei circuiti neurali durante lo sviluppo del sistema nervoso. Gravi danni ai neuriti e disfunzioni sinaptiche si verificano in varie malattie neurodegenerative e degenerazione legata all’età. Lo studio dei meccanismi che regolano l’escrescenza neurite non solo getterebbe luce preziosa sui processi di sviluppo cerebrale, ma anche su tali disturbi neurologici. A causa della bassa efficienza di trasfezione, è attualmente difficile studiare l’effetto di una proteina specifica sulla escrescenza di neurite nei neuroni dei mammiferi primari. Qui, descriviamo un metodo semplice per lo studio dell’escrescenza neurite dalla co-trasfezione dei neuroni corticali del ratto primario con EGFP e una proteina di interesse (POI). Questo metodo consente l’identificazione dei neuroni trafettati POI attraverso il segnale EGFP, e quindi l’effetto del POI sulla crescita di neurite può essere determinato con precisione. Questo saggio basato su EGFP fornisce un approccio conveniente per lo studio dei percorsi che regolano la crescita neurite.
Introduction
Neuriti, compresi sia assoni che dendriti, sono le proiezioni dei neuroni coinvolti nella creazione delle reti neurali. La crescita dinamica dei neuriti è essenziale per il neurosviluppo. Tuttavia, i meccanismi normativi sottostanti rimangono poco chiari. In particolare, il danno neurite è spesso osservato in varie malattie neurodegenerative e dopo lesioni cerebrali1. Pertanto, lo studio dei ruoli delle molecole putative in vari percorsi normativi di escrescenza neurite migliorerebbe la nostra comprensione del processo. Inoltre, può rivelare nuovi bersagli terapeutici per vari disturbi neurologici. Le linee cellulari neuronali sono modelli preziosi per studiare i processi neuronali tra cui l’escrescenza di neurite in quanto sono facili da manipolare e trasfect2,3. Tuttavia, deriva genetica è stata segnalata per verificarsi in alcune linee cellulari comunemente utilizzate, che potrebbero portare a variazioni nelle loro risposte fisiologiche4. Inoltre, è stata mostrata un’espressione differenziale di proteina tra le linee cellulari neuronali e i neuroni primari. Per esempio, PC12, una linea cellulare neuronale derivata dalla ghiandola surrenale del ratto che è ampiamente utilizzata per studiare la crescita neurite2,3, non esprime i recettori NMDA5. Inoltre, è stato proposto che la ridotta reattività della linea neuroblastoma del topo neuro-2a alle neurotossine rispetto ai neuroni primari è dovuta alla mancanza di espressione di alcuni recettori della membrana e canali ionici6. Pertanto, i neuroni primari sono un modello più desiderabile e rappresentativo per lo studio della escrescenza di neurite. Tuttavia, l’uso di neuroni primari è ostacolato dalla loro bassa efficienza di trasfezione7.
Qui, descriviamo un metodo che comporta la co-trasfezione della proteina di interesse (POI) e EGFP ai neuroni corticali del ratto primario. L’EGFP agisce come marcatore morfologico per l’identificazione di neuroni trasfettati con successo e permette la misurazione dei neuriti. Abbiamo convalidato questo metodo utilizzando composti/molecole che sono stati segnalati per modulare la crescita dei neurite. Inoltre, FE65, una proteina adattatrice neuronale che ha dimostrato di stimolare la crescita neurite, è stata utilizzata per illustrare questo approccio8,9. Questo protocollo prevede (1) l’isolamento dei neuroni corticali primari dagli embrioni del giorno embrionale 18 (E18) sugli embrioni di ratto, (2) la co-trasfezione dei neuroni con EGFP e poi (FE65 in questo studio) e (3) l’imaging e l’analisi dei neuroni utilizzando l’elaborazione delle immagini software ImageJ con il plugin NeuronJ10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come detto prima, PC12 e i suoi subclone sono ampiamente impiegati per studiare l’estensione neurite perché hanno un’eccellente efficienza di trasfezione2,3. Al contrario, i neuroni primari hanno un basso tasso di trasfezione, che è un grande ostacolo per studiare i regolatori di escrescenza neurite per trasfezione7. Qui, descriviamo un protocollo conveniente per quantificare la crescita dei neuriti nei neuroni primari. Nonostante la bas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del Research Grants Council Hong Kong, Health and Medical Research Fund (Hong Kong), del CUHK direct grant scheme, del Fondo di dotazione dello United College e del TUYF Charitable Trust.
Materials
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO. |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
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