प्राथमिक न्यूरॉन्स में Neurite आउटवृद्धि के अध्ययन के लिए एक बढ़ी हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित परख
Summary
इस रिपोर्ट में, हम EGFP और ब्याज के प्रोटीन के साथ सह-transfecting द्वारा भ्रूण चूहे cortical न्यूरॉन्स में neurite वृद्धि का अध्ययन करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
न्यूराइट आउटग्रोथ तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान तंत्रिका सर्किट के गठन में एक मौलिक घटना है। गंभीर न्यूराइट क्षति और synaptic रोग विभिन्न neurodegenerative रोगों और उम्र से संबंधित अध: पतन में होते हैं. तंत्र है कि neurite वृद्धि को विनियमित की जांच न केवल मस्तिष्क विकास प्रक्रियाओं पर मूल्यवान प्रकाश डाला जाएगा, लेकिन यह भी इस तरह के मस्तिष्क संबंधी विकारों पर. कम transfection दक्षता के कारण, यह वर्तमान में प्राथमिक स्तनधारी न्यूरॉन्स में neurite outgrowth पर एक विशिष्ट प्रोटीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. यहाँ, हम EGFP और ब्याज की एक प्रोटीन (POI) के साथ प्राथमिक चूहे cortical न्यूरॉन्स के सह-परिवर्तन द्वारा neurite वृद्धि की जांच के लिए एक सरल विधि का वर्णन. इस विधि EGFP संकेत के माध्यम से POI transfected न्यूरॉन्स की पहचान की अनुमति देता है, और इस प्रकार neurite outgrowth पर POI के प्रभाव ठीक निर्धारित किया जा सकता है. इस EGFP आधारित परख neurite आउटवृद्धि को विनियमित रास्ते की जांच के लिए एक सुविधाजनक दृष्टिकोण प्रदान करता है.
Introduction
Neurites, दोनों axons और dendrites सहित, तंत्रिका नेटवर्क की स्थापना में शामिल न्यूरॉन्स से अनुमानों रहे हैं. तंत्रिका विकास के लिए न्यूराइट की गतिशील वृद्धि आवश्यक है। हालांकि, नीचे अंतर्निहित नियामक तंत्र स्पष्ट नहीं है। विशेष रूप से, न्यूराइट क्षति अक्सर विभिन्न neurodegenerative रोगों में और मस्तिष्क की चोटों के बादमनाया जाता है 1. इसलिए, विभिन्न न्यूराइट आउटग्रोथ नियामक रास्ते में putative अणुओं की भूमिका की जांच प्रक्रिया की हमारी समझ में सुधार होगा. इसके अलावा, यह विभिन्न न्यूरोलॉजिकल विकारों के लिए उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्य प्रकट कर सकते हैं. तंत्रिका कोशिका रेखाएं तंत्रिका प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान मॉडल हैं जिनमें न्यूराइट आउटग्रोथ भी शामिल है क्योंकि उनमें हेरफेर और ट्रांसफेक्ट2,3में आसानी होती है . तथापि, आनुवंशिक बहाव कुछ सामान्य रूप से प्रयुक्त कोशिका लाइनों में होने की सूचना मिली है, जो उनकी शारीरिक प्रतिक्रियाओं में बदलाव का कारण बन सकतीहै 4. इसके अलावा, अंतर प्रोटीन अभिव्यक्ति न्यूरॉन सेल लाइनों और प्राथमिक न्यूरॉन्स के बीच दिखाया गया है. उदाहरण के लिए, पीसी 12, चूहे अधिवृक्क ग्रंथि से व्युत्पन्न एक न्यूरोनल सेल लाइन जो व्यापक रूप से न्यूराइट आउटग्रोथ2,3, NMDA रिसेप्टर्स5व्यक्त नहीं करता है के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है। इसके अलावा, यह प्रस्ताव किया गया है कि प्राथमिक न्यूरॉन्स की तुलना में neurotoxins के लिए माउस neuroblastoma लाइन neuro-2a की कम प्रतिक्रिया कुछ झिल्ली रिसेप्टर्स और आयन चैनलों की अभिव्यक्ति की कमी के कारण है6. इसलिए, प्राथमिक न्यूरॉन्स neurite वृद्धि की जांच के लिए एक अधिक वांछनीय और प्रतिनिधि मॉडल हैं. हालांकि, प्राथमिक न्यूरॉन्स का उपयोग उनके कम transfection दक्षता7द्वारा बाधित है.
यहाँ, हम एक विधि है कि ब्याज के प्रोटीन के सह संक्रमण शामिल का वर्णन (POI) और प्राथमिक चूहे cortical न्यूरॉन्स के लिए EGFP. EGFP सफलतापूर्वक transfected न्यूरॉन्स की पहचान के लिए एक रूपात्मक मार्कर के रूप में कार्य करता है और neurites की माप परमिट. हमने इस विधि को उन यौगिकों/अणुओं का उपयोग करके मान्य किया है जिनकी सूचना न्यूराइट आउटग्रोथ को मॉड्युलेट करने के लिए सूचित की गई है। इसके अलावा, FE65, एक न्यूरॉन एडेप्टर प्रोटीन है कि neurite वृद्धि को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया है, इस दृष्टिकोण को समझाने के लिए इस्तेमाल किया गया था8,9. इस प्रोटोकॉल शामिल है (1) भ्रूण दिन से प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स के अलगाव 18 (E18) चूहे भ्रूण, (2) EGFP और POI के साथ न्यूरॉन्स के सह-परिवर्तन (इस अध्ययन में FE65) और (3) इमेजिंग और छवि प्रसंस्करण का उपयोग करके न्यूरॉन्स के विश्लेषण NeuronJ प्लगइन10,11के साथ सॉफ्टवेयर ImageJ .
Protocol
Representative Results
Discussion
जैसा कि पहले कहा गया है, पीसी 12 और इसके सबक्लोन को न्यूराइट एक्सटेंशन का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से नियोजित किया जाता है क्योंकि उनके पास उत्कृष्ट ट्रांसफेक्शन दक्षता2,3है । ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को अनुसंधान अनुदान परिषद हांगकांग, स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान कोष (हांगकांग), सीयूएचके प्रत्यक्ष अनुदान योजना, यूनाइटेड कॉलेज एंडोमेंट फंड और टीयूवाईएफ चैरिटेबल ट्रस्ट से धन द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO. |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
- Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
- Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
- Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
- Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
- Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
- Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
- Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
- Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
- Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
- He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
- Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)–soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
- Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
- Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).
- Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
- Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
- Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).
