항원 펩타이드 및 Fc-III 모방제(DCAF)의 이중 기능 성 컨쥬게이트에 의한 표적 항체 차단
Summary
항원 펩타이드 및 Fc-III 모방제(DCAF)의 이중 기능성 컨쥬게이트 개발은 유해한 항체의 제거를 위한 새로운 것입니다. 여기서, 우리는 뎅기열 바이러스 감염 동안 항체 의존성 증강 효과를 제거하기 위해 4G2 항체를 선택적으로 차단할 수 있는 DCAF1 분자의 합성을 위한 상세한 프로토콜을 기술한다.
Abstract
유기체에서 유해한 항체의 제거는 뎅기열 출혈열 및 자기 면역 질병과 같은 항체 관련 질병의 개입을 위한 귀중한 접근입니다. 상이한 에피토프를 가진 수천 개의 항체가 혈액에서 순환하기 때문에, 항원 펩타이드 및 Fc-III 모방제(DCAF)의 이중 기능적 컨쥬게이트를 제외한 보편적인 방법은 없으며, 특이적인 유해 항체를 표적으로 하는 것으로 보고되었다. DCAF 분자의 발달은 뎅기열 바이러스 (DENV) 감염 모델에서 항체 의존성 향상 (ADE) 효과를 제거하고 아세틸 콜린을 향상시키는 것으로 입증 된 표적 치료의 진행에 상당한 기여를합니다. 중증 근무모델의 수용체 활성. 여기서, 우리는 뎅기열 바이러스 감염 동안 ADE 효과를 감쇠시키기 위해 4G2 항체를 선택적으로 차단할 수 있는 DCAF 분자(DCAF1)의 합성을 위한 프로토콜을 설명하고, ELISA 분석에 의한 DCAF1 to 4G2 항체의 결합을 예시한다. 본 방법에서, DCAF1은 Fc-III 펩타이드의 히드라진 유도체의 컨쥬레이션에 의해 합성되고 재조합이 네이티브 화학 적 결찰(NCL)을 통해 항원 서열로 긴 α-나선을 발현한다. 이 프로토콜은 그들의 코그네이트 항체를 표적으로 하기 위한 DCAF1 및 그밖 DCAF 분자에 성공적으로 적용되었습니다.
Introduction
항체는 병원성 박테리아 및 바이러스의 중화에 대한 체액 면역 반응에 중요한 역할을 한다1. 그러나, 일부 항체는 자가면역 질환인 중증근무증에서 DENV 감염 및 과민반응성 항체 동안 ADE 효과에서 교차 반응성 항체와 같은 유기체에 유해한 영향을 나타낸다2,3. ADE 효과는 DENV와 Fc 수용체 제시 세포를 연결하는 다리를 만드는 교차 반응성 항체에 의해 매개되는반면,중증근무력증은 아세틸콜린 수용체를 공격하는 과도한 항체에 의해 유발됩니다. 근육 조직에 있는 세포 세포 접합 사이6,7. 부분적으로 효과적인 접근법이 이 질병을 취급하기 위하여 개발되었더라도8,9,의심할 여지없이 이러한 유해한 항체의 직접적인 제거는 내정간섭을 위한 진전을 만들 것입니다.
최근에는 이중 작용기가 있는 DCAF 분자가 표적 항체 차단10을위해 개발되었다. DCAF는 3부분으로 구성된 긴 펩티드이다: 1) 코그네이트 항체를 특이하게 인식할 수 있는 항원 부분, 2) Fc-III 또는 Fc-III-4C 태그는 Fc 수용체 또는 보체 성분 단백질중 하나를 억제하기 위해 항체의 Fc 영역에 강하게 결합한다. , 3) 이들 두 기능성그룹(10)을접합하는 긴 α-헬리칼 링커. Moesin FERM 도메인에서 설계된 링커 부품은 로세타 소프트웨어에 의해 최적화되어 DCAF 분자의 항원 부분과 Fc-III 부품이 IgG의 팹 및 Fc 영역에 동시에 결합할 수 있도록 합니다. 4개의 DCAF 분자가 4개의 상이한 항체를 표적으로 하기 위해 합성되었고, 그 중DCAF1은 4G2 항체를 제거하는데 사용되었으며, 이는 DENV 감염 동안 교차 반응성 항체가 ADE 효과에 기여한다; 및 DACF4는 중증 근무력증10에서mab35 항체를 차단하여 아세틸콜린 수용체의 구조를 위해 설계되었습니다.
본 연구에서, 예로서 DCAF1을 촬영, 우리는 DCAF 분자의 합성 및 DCAF와 그의 동체 항체 사이의 상호 작용의 검출을위한 프로토콜을 보여 주었다. DCAF1은 NCL 접근법11,12,13,14에의해 반합성되며, 이는 Fc-III 펩타이드 및 발현된 링커-항원 부분의 히드라진 유도체를 함께 접합한다. NCL 접근법은 이러한 두 방법 모두 낮은 수율 및 높은 비용으로 이어지기 때문에 DCAF1 합성을 위한 완전 화학적 합성 및 완전 재조합 발현에 비해 상당한 이점이 있다. 현재의 접근 방식은 전체 길이 DCAF를 얻는 가장 비용 효율적인 방법일 뿐만 아니라 링커 부품의 형태를 기본 형태와 유사하게 유지할 수 있습니다. 상이한 DCAF 분자는 항원 부품을 제외한 유사한 서열을 갖기 때문에, DCAF1 과 4G2 항체 사이의 DCAF1 합성 및 상호작용 분석법을 위한 우리의 방법은 그들의 코그네이트 항체를 표적화하기 위해 다른 DCAF 분자에도 적용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 프로토콜은 도 1에도시된 NCL 접근법을 사용하여 DCAF1의 반합성 및 검출에 대해 설명한다. 간략하게, DCAF1의 두 단편은 각각 화학적으로 합성되고 재조합적으로 발현되는; 그런 다음, 전체 길이 DCAF1 분자가 조립, 변형 및 정제된다. 히드라진 유래 Fc-III 단편 합성의 경우, 고용량이 히드라진 생성에 부정적인 영향을 미치고 제품의 낮은 수율을 유도하기 때문에 저용량 2-C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 칭화 대학 – 게이츠 재단 (아니. OPP1021992), 중국 국립 자연 과학 재단 (번호 21502103, 21877068 및 041301475), 그리고 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (번호 2017YFA0505103).
Materials
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. . Human Physiology (4th ed.). , (2003).
- Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
- Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
- Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
- Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
- Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis – autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
- Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
- Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
- Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
- Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
- Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
- Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
- Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
- Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).
