Gezielte Antikörperblockierung durch ein dual-funktionales Konjugat von antigenem Peptid und Fc-III-Mimetik (DCAF)
Summary
Die Entwicklung eines dual-funktionalen Konjugats von antigenem Peptid und Fc-III-Mimetik (DCAF) ist neu für die Beseitigung schädlicher Antikörper. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Synthese von DCAF1-Molekül, das selektiv 4G2-Antikörper blockieren kann, um Antikörper-abhängige Verbesserungseffekt während der Dengue-Virusinfektion zu beseitigen.
Abstract
Die Beseitigung schädlicher Antikörper aus Organismen ist ein wertvoller Ansatz für die Intervention von Antikörper-assoziierten Krankheiten wie Dengue-Hämorrhagischem Fieber und Autoimmunerkrankungen. Da Tausende von Antikörpern mit unterschiedlichen Epitopen im Blut zirkulieren, wurde keine universelle Methode, mit Ausnahme des dual-funktionalen Konjugats von antigenen Peptid- und Fc-III-Mimetiken (DCAF), berichtet, spezifische schädliche Antikörper zu zielen. Die Entwicklung von DCAF-Molekülen leistet einen wesentlichen Beitrag zum Fortschritt der zielgerichteten Therapie, die gezeigt wurde, um den Antikörper-abhängigen Verbesserungseffekt (ADE) in einem Dengue-Virus-Infektionsmodell (DENV) zu eliminieren und das Acetylcholin-Infektionsmodell zu steigern. Rezeptoraktivität in einem Myasthenia gravis Modell. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Synthese eines DCAF-Moleküls (DCAF1), das selektiv 4G2-Antikörper blockieren kann, um den ADE-Effekt während der Dengue-Virusinfektion abzuschwächen, und die Bindung von DCAF1- an 4G2-Antikörper durch einen ELISA-Assay veranschaulichen kann. Bei unserer Methode wird DCAF1 durch die Konjugation eines Hydrazinderivats eines Fc-III-Peptids und einer rekombinanten, langen,-Helix mit antigener Sequenz durch native chemische Ligation (NCL) synthetisiert. Dieses Protokoll wurde erfolgreich auf DCAF1 sowie andere DCAF-Moleküle angewendet, um ihre Cognate-Antikörper gezielt zu untersuchen.
Introduction
Antikörper spielen eine wichtige Rolle bei der humoralen Immunantwort zur Neutralisierung pathogener Bakterien und Viren1. Einige Antikörper zeigen jedoch schädliche Auswirkungen auf die Organismen, wie kreuzreaktive Antikörper im ADE-Effekt während der DENV-Infektion und überreaktive Antikörper in Myasthenia gravis, was eine Autoimmunerkrankungist 2,3. ADE-Effekt wird durch die kreuzreaktiven Antikörper vermittelt, die die Brücke bilden, um DENV und Fc-Rezeptor präsentierenden Zellen4,5, während Myasthenia gravis durch die übermäßigen Antikörper verursacht wird, die Acetylcholin-Rezeptoren angreifen zwischen den Zell-Zell-Kreuzungen im Muskelgewebe6,7. Obwohl teilweise wirksame Ansätze zur Behandlung dieser Krankheiten entwickelt wurden8,9, würde zweifellos die direkte Beseitigung dieser schädlichen Antikörper Fortschritte bei den Interventionen machen.
Kürzlich wurden DCAF-Moleküle, die dual-funktionelle Gruppen haben, für die gezielte Antikörperblockierung10entwickelt. DCAF ist ein langes Peptid, das aus 3 Teilen besteht: 1) ein Antigenteil, das den Cognate-Antikörper spezifisch erkennen kann, 2) ein Fc-III- oder Fc-III-4C-Tag zur starken Bindung an den Fc-Bereich des Antikörpers, um entweder Fc-Rezeptor- oder Komplement-Komponentenproteine zu hemmen , 3) ein langer ,-Helical-Linker, der diese beiden funktionellen Gruppen10konjugiert. Das Linker-Teil, das von der Moesin FERM-Domäne entwickelt wurde, wurde von der Rosseta-Software optimiert, um sicherzustellen, dass das Antigen- und das Fc-III-Teil in einem DCAF-Molekül gleichzeitig an die Fab- und Fc-Regionen von IgG binden kann. Vier DCAF-Moleküle wurden synthetisiert, um 4 verschiedene Antikörper anzusprechen, darunter DCAF1 wurde verwendet, um 4G2-Antikörper zu eliminieren, der ein kreuzreaktiver Antikörper während der DENV-Infektion ist, um zur ADE-Wirkung beizutragen; und DACF4 wurde für die Rettung von Acetylcholin-Rezeptoren durch Blockierung mab35 Antikörper in Myasthenia gravis10entwickelt.
In der vorliegenden Studie, die DCAF1 als Beispiel annahm, zeigten wir die Protokolle für die Synthese von DCAF-Molekülen und den Nachweis der Wechselwirkung zwischen einem DCAF und seinem cognate Antikörper. Der DCAF1 wird durch NCL-Ansatz11,12,13,14, der das Hydrazinderivat eines Fc-III-Peptids und die exprimierten Linker-Antigen-Teile zusammenverbindet, halbsynthetiert. Der NCL-Ansatz hat erhebliche Vorteile gegenüber vollständig chemischer Synthese und vollständig rekombinanter Expression für die DCAF1-Synthese, da beide Methoden zu geringem Ertrag und hohen Kosten führen. Der aktuelle Ansatz ist nicht nur der kostengünstigste Weg, um die DCAF in voller Länge zu erhalten, sondern kann auch die Konformation des Linkerteils ähnlich wie seine native Form beibehalten. Da verschiedene DCAF-Moleküle ähnliche Sequenzen haben, mit Ausnahme der Antigenteile, können unsere Methoden zur DCAF1-Synthese und der Interaktionstest zwischen DCAF1- und 4G2-Antikörpern auch auf andere DCAF-Moleküle angewendet werden, um gezielt ihre Cognate-Antikörper zu blockieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll beschreibt hier die Semisynthese und Detektion von DCAF1 mithilfe des NCL-Ansatzes, der in Abbildung 1dargestellt ist. Kurz gesagt, die beiden Fragmente von DCAF1 sind chemisch synthetisiert bzw. rekombinant exprimiert; dann wird das DCAF1-Molekül in voller Länge zusammengesetzt, modifiziert und gereinigt. Für die hydrazin abgeleitete Fc-III-Fragmentsynthese ist die Verwendung von 2-Cl-Harz mit geringer Kapazität sehr wichtig, da eine hohe Kapazität einen negativen Effekt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise von der Tsinghua University-Gates Foundation (Nr. OPP1021992), die National Natural Science Foundation of China (Nr. 21502103, 21877068 und 041301475) und das National Key Research and Development Program of China (Nr. 2017YFA0505103).
Materials
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
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