Summary

Antijenik Peptid ve Fc-III Mimetics (DCAF) Çift Fonksiyonlu Konjuge tarafından Hedefli Antikor Engelleme

Published: September 17, 2019
doi:

Summary

Antijenik peptid ve Fc-III mimetik (DCAF) çift fonksiyonlu bir konjuge gelişimi zararlı antikorların ortadan kaldırılması için yeni bir yeniliktir. Burada, Dang virüsü enfeksiyonu sırasında antikorbağımlı geliştirme etkisini ortadan kaldırmak için seçici olarak 4G2 antikor engelleyebilir DCAF1 molekülünün sentezi için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Abstract

Zararlı antikorların organizmalardan uzaklaşması, Dang hemorajik ateş ve otoimmün hastalıklar gibi antikorilişkili hastalıkların müdahalesi için değerli bir yaklaşımdır. Farklı epitopslara sahip binlerce antikor kanda dolaştığından, antijenik peptid ve Fc-III mimetik (DCAF) çift fonksiyonlu konjuge dışında evrensel bir yöntemin spesifik zararlı antikorları hedef ettiği bildirilmiştir. DCAF moleküllerinin gelişimi, dang virüsü (DENV) enfeksiyon modelinde antikor bağımlı geliştirme (ADE) etkisini ortadan kaldırmak ve asetilkolinartırmak için gösterilmiştir hedefli tedavi, ilerlemesine önemli katkı yapar bir miyastenia gravis modelinde reseptör aktivitesi. Burada, Dang virüs enfeksiyonu sırasında ADE etkisini zayıflatmak için 4G2 antikorunu seçici olarak bloke eden ve DCAF1 ile 4G2 antikorunun ELISA testi ile bağlanmasını gösteren bir DCAF molekülünün (DCAF1) sentezine yönelik bir protokolü tanımlıyoruz. Yöntemimizde DCAF1, fc-III peptidin hidrat türevinin konjugasyonu ve doğal kimyasal ligasyon (NCL) yoluyla antijenik diziliuzun uzun α-sarlis ifade edilmesi yle sentezlenir. Bu protokol, cognate antikorlarını hedeflemek için DCAF1’e ve diğer DCAF moleküllerine başarıyla uygulanmıştır.

Introduction

Antikorlar patojenik bakteri ve virüslerin nötralizasyonu için humoral immün yanıt önemli rol oynamaktadır1. Ancak, bazı antikorlar organizmalar için zararlı etkiler sergiler, DENV enfeksiyonu sırasında ADE etkisi çapraz reaktif antikorlar ve miyasteni ait gravis aşırı reaktif antikorlar gibi, hangi bir otoimmünhastalıklar2,3. ADE etkisi DENV ve Fc reseptör sunan hücreleri bağlamak için köprü yapmak çapraz reaktif antikorlar aracılık edilir4,5, miyasteni gravis asetilkolin reseptörlerine saldıran aşırı antikorlar neden olurken kas dokusunda hücre-hücre kavşakları arasında6,7. Bu hastalıkların tedavisinde kısmen etkili yaklaşımlar geliştirilmiş olmasına rağmen8,9, şüphesiz bu zararlı antikorların doğrudan ortadan kaldırılması müdahaleler için ilerleme olacaktır.

Son zamanlarda, çift fonksiyonlu gruplara sahip DCAF molekülleri, hedefli antikor blokaj ı için geliştirilmiştir10. DCAF 3 bölümden oluşan uzun bir peptittir: 1) spesifik bir antijen parçası cognate antikor tanıyabilir, 2) fc-III veya Fc-III-4C etiketi güçlü antikor Fc bölgesine bağlı ya Fc reseptör veya kompleman bileşen proteinleri inhibe etmek için , 3) bu iki fonksiyonel grup10conjugates uzun bir α-sarmal bağlayıcı . Moesin FERM etki alanından tasarlanan bağlantı parçası, Bir DCAF molekülündeki antijen ve Fc-III kısmının aynı anda IgG’nin Fab ve Fc bölgelerine bağlanabilmesini sağlamak için Rosseta yazılımı tarafından optimize edildi. Dört DCAF molekülleri hedef 4 farklı antikorlar için sentezlenmiş, aralarında DCAF1 4G2 antikor ortadan kaldırmak için kullanılmıştır, Hangi DENV enfeksiyonu sırasında çapraz reaktif antikor ADE etkisine katkıda bulunmak için; ve DACF4 miyasteni ait gravis10mab35 antikor engelleyerek asetilkolin reseptörlerinin kurtarılması için tasarlanmıştır.

Örnek olarak DCAF1’i örnek alan bu çalışmada, DCAF molekülünün sentezi ve DCAF ve bilişli antikor arasındaki etkileşimin saptanması için protokolleri gösterdik. DCAF1 ncl yaklaşım11,12,13,14, bir Fc-III peptid hidrat türevi ve ifade bağlayıcı-antijen parçaları birlikte conjugates tarafından yarı sentezlenir. Her iki yöntem de düşük verim ve yüksek maliyetyol çünkü NCL yaklaşımı, tam kimyasal sentezve DCAF1 sentezi için tam rekombinant ifade üzerinde önemli avantajlara sahiptir. Mevcut yaklaşım sadece tam uzunlukta DCAF almak için en uygun maliyetli bir yoldur, ama aynı zamanda yerel formu olarak benzer bağlayıcı parçasının konformasyon koruyabilirsiniz. Farklı DCAF molekülleri antijen parçaları dışında benzer dizilere sahip olduğundan, DCAF1 sentezi ve DCAF1 ve 4G2 antikorları arasındaki etkileşim telimizden dolayı yöntemlerimiz diğer DCAF moleküllerine uygulanabilir ve bu moleküllerin biliş antikorlarını bloke etmek hedeflenebilir.

Protocol

1. Fc-III peptidin hidrazin türevinin kimyasal sentezi 2-Cl-(Trt)-Cl rezorinin 2-Cl-(Trt)-NHNH2 rezorne ye dönüştürülmesi 25 mL’lik peptid sentez damarına 625 mg 2-Cl-(Trt)-Cl reçine (0.25 mmol) ağırlığındadır. Geminin üst kısmından reçine 5 mL N,N-dimethylformamide (DMF) ekleyin, kapağı geri koyun, yavaşça 15 s için damar ıslayın ve sonra drenaj. DMF yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Damara 5 mL diklorometan (DCM) ekleyin,…

Representative Results

Bu makalede yerli kimyasal ligasyon ile sentez yolu için akış şeması Şekil 1’degösterilmiştir. Şekil 2-6, fc-III peptidin kimyasal sentezlenmiş hidrazin türevi kromatogramlarını (A) ve kütle spektrumlarını(B)gösterir, rekombinant ifade bağlayıcısı ve antijen parçası, NCL reaksiyonundan saflaştırılmış ürün, saflaştırılmış desülfürizasyon reaksiyonu ve saflaştırılmış nihai ürün DCAF1 ürün, sırası…

Discussion

Buradaki protokol, Şekil 1’degösterilen NCL yaklaşımı kullanılarak DCAF1’in yarı sentezini ve saptanması açıklanmaktadır. Kısaca, DCAF1’in iki parçası sırasıyla kimyasal sentezlenir ve yeniden ifade edilir; sonra, tam uzunlukta DCAF1 molekülü monte edilir, modifiye ve saflaştırılır. Hydrazine türetilen Fc-III parça sentezi için, düşük kapasiteli 2-Cl reçine kullanımı oldukça önemlidir, çünkü yüksek kapasiteli hidrazin üretimi için olumsuz bir etkiye sah…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma kısmen Tsinghua Üniversitesi-Gates Vakfı (hayır. OPP1021992), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (no. 21502103, 21877068 ve 041301475) ve Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (no. 2017YFA0505103).

Materials

2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

References

  1. Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. . Human Physiology (4th ed.). , (2003).
  2. Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
  3. Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
  4. Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
  5. Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
  6. Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis – autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
  7. Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
  8. Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
  9. Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
  10. Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
  11. Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
  12. Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
  13. Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
  14. Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).

Play Video

Cite This Article
Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

View Video