Summary

Blocco mirato degli anticorpi da parte di un coniugato dual-funzionale di Peptide antigenico e mimetica Fc-III (DCAF)

Published: September 17, 2019
doi:

Summary

Lo sviluppo di un coniugato dual-funzionale di peptidi antigenici e mimetici Fc-III (DCAF) è nuovo per l’eliminazione di anticorpi nocivi. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la sintesi della molecola DCAF1, che può bloccare selettivamente l’anticorpo 4G2 per eliminare l’effetto di miglioramento dipendente dagli anticorpi durante l’infezione da virus Dengue.

Abstract

L’eliminazione di anticorpi nocivi dagli organismi è un approccio prezioso per l’intervento di malattie associate agli anticorpi, come la febbre emorragica dengue e le malattie autoimmuni. Poiché migliaia di anticorpi con epitopi diversi circolano nel sangue, nessun metodo universale, ad eccezione del coniugato dual-funzionale di peptidi antigenici e mimetici Fc-III (DCAF), è stato segnalato per colpire specifici anticorpi nocivi. Lo sviluppo di molecole DCAF dà un contributo significativo al progresso della terapia mirata, che sono stati dimostrati per eliminare l’effetto di miglioramento dipendente dagli anticorpi (ADE) in un modello di infezione del virus Dengue (DENV) e per aumentare l’acetilcolina l’attività recettore in un modello di myasthenia gravis. Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di una molecola DCAF (DCAF1), che può bloccare selettivamente l’anticorpo 4G2 per attenuare l’effetto ADE durante l’infezione da virus Dengue e illustrare il legame dell’anticorpo DCAF1-4G2 da un saggio ELISA. Nel nostro metodo, la DCAF1 è sintetizzata dalla coniugazione di un derivato idrossizzante di un peptide Fc-III e un ricombinante espresso lungo elicoia con sequenza antigenica attraverso la legatura chimica nativa (NCL). Questo protocollo è stato applicato con successo a DCAF1 e ad altre molecole DCAF per colpire i loro anticorpi cognati.

Introduction

Gli anticorpi svolgono un ruolo importante nella risposta immunitaria umorale per la neutralizzazione di batteri e virus patogeni1. Tuttavia, alcuni anticorpi presentano impatti nocivi per gli organismi, come anticorpi cross-reattivi nell’effetto ADE durante l’infezione Da DENV e anticorpi sovrareattivi nella mioasthenia gravis, che è una malattia autoimmune2,3. L’effetto ADE è mediato dagli anticorpi cross-reattivi che rendono il ponte per collegare DENV e il recettore Fc presentando le cellule4,5, mentre la mioastenia gravis è causata dagli anticorpi eccessivi che attaccano i recettori dell’acetilcolina tra le giunzioni cellule-cellule nel tessuto muscolare6,7. Sebbene siano stati sviluppati approcci parzialmente efficaci per il trattamento di queste malattie8,9, senza dubbio l’eliminazione diretta di questi anticorpi nocivi farebbe progressi per gli interventi.

Recentemente, le molecole DCAF, che hanno gruppi dual-funzionali, sono state sviluppate per il blocco mirato degli anticorpi10. DCAF è un lungo peptide composto da 3 parti: 1) una parte dell’antigene in grado di riconoscere specifiche le sostanze anticorpi cognati, 2) un tag Fc-III o Fc-III-4C per legare fortemente alla regione Fc dell’anticorpo per inibire il recettore Fc o proteine componenti del complemento , 3) un lungo linker con elica a z che coniuga questi due gruppi funzionali10. La parte del linker, progettata dal dominio Moesin FERM, è stata ottimizzata dal software Rosseta per garantire che la parte antigene e la parte Fc-III in una molecola DCAF possano legarsi contemporaneamente alle regioni Fab e Fc di IgG. Quattro molecole DCAF sono state sintetizzate per colpire 4 diversi anticorpi, tra cui DCAF1 è stato utilizzato per eliminare l’anticorpo 4G2, che è un anticorpo cross-reattivo durante l’infezione da DENV per contribuire all’effetto ADE; e DACF4 è stato progettato per il salvataggio dei recettori dell’acetilcolina bloccando l’anticorpo mab35 in myasthenia gravis10.

Nel presente studio, preso DCAF1 come esempio, abbiamo mostrato i protocolli per la sintesi della molecola DCAF e la rilevazione dell’interazione tra una DCAF e il suo anticorpo cognato. La DCAF1 è semi-sintetizzata dall’approccio NCL11,12,13,14, che coniuga il derivato dell’iddrina di un peptide Fc-III e le parti linker-antigene espresse insieme. L’approccio NCL ha vantaggi significativi rispetto alla sintesi completamente chimica e all’espressione completamente ricombinante per la sintesi DCAF1, perché entrambi questi metodi portano a una bassa resa e ad un costo elevato. L’approccio attuale non è solo il modo più conveniente per ottenere l’intera lunghezza DCAF, ma può anche mantenere la conformazione della parte del linker simile alla sua forma nativa. Poiché diverse molecole DCAF hanno sequenze simili ad eccezione delle parti dell’antigene, i nostri metodi per la sintesi DCAF1 e l’analisi di interazione tra gli anticorpi DCAF1 e 4G2 possono essere applicati ad altre molecole DCAF per bloccare mirati anche i loro anticorpi cognati.

Protocol

1. Sintesi chimica del derivato dell’idzina di un peptide Fc-III Conversione della resina 2-Cl-(Trt)-Cl in resina 2-Cl-(Trt)-NHNH2 Pesare 625 mg di resina 2-Cl-(Trt)-Cl (0,25 mmol) in un recipiente di sintesi peptide da 25 ml. Aggiungere 5 mL di N,N-dimethylformamide (DMF) alla resina dalla parte superiore del vaso, mettere il tappo indietro, scuotere delicatamente il vaso per 15 s e quindi scolarlo. Ripetere il lavaggio DMF per altre due volte. Aggiun…

Representative Results

Il diagramma di flusso per il percorso di sintesi per legatura chimica nativa in questo articolo è illustrato nella Figura 1. Le figure 2-6 mostrano i cromatogrammi (A) e gli spettri di massa (B) del derivato di iddrina sintetizzato chimico di un peptide Fc-III, linker espresso ricombinante e parte dell’antigene, il prodotto purificato dalla reazione NCL, il purificato reazione di desulfurazione e del prodotto finale purificato DCAF1, rispe…

Discussion

Il protocollo qui descrive la semisintesi e il rilevamento di DCAF1 utilizzando l’approccio NCL, come illustrato nella Figura 1. In breve, i due frammenti di DCAF1 sono sintetizzati chimicamente e ricombinantemente espressi, rispettivamente; quindi, la molecola DCAF1 di intera lunghezza viene assemblata, modificata e purificata. Per la sintesi del frammento fc-III derivato da idzina, l’utilizzo di resina a 2 Cl a bassa capacità è molto importante, perché l’alta capacità ha un effetto neg…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Tsinghua University-Gates Foundation (n. OPP1021992), la National Natural Science Foundation of China (n. 21502103, 21877068 e 041301475), e il National Key Research and Development Program of China (n. 2017YFA0505103).

Materials

2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

References

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Cite This Article
Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

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